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人子宮內(nèi)膜上皮細胞永生化

一、細胞基本屬性

細胞詳述

子宮是產(chǎn)生月經(jīng)和孕育胎兒的器官，位于骨盆腔中央，在膀胱與直腸之間。子宮內(nèi)膜即粘膜，由上皮（屬單層柱狀上皮，有分泌細胞和纖毛細胞二種）和（由結(jié)締組織構(gòu)成，其內(nèi)有大量的星形細胞，稱為基質(zhì)細胞）固有膜組成。

子宮內(nèi)膜是指構(gòu)成哺乳類子宮內(nèi)壁的一層。子宮內(nèi)膜對動情素和孕激素都起反應(yīng)，因此可隨著性周期（發(fā)情周期、月經(jīng)周期）發(fā)生顯著的變化。子宮內(nèi)膜覆蓋著粘膜，由粘膜上皮與其下方的固有層所組成。粘膜上皮為柱狀上皮、立方上皮或復層柱狀上皮，動情素分泌時，各上皮細胞將長大、分裂使數(shù)目增多。

該細胞通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式攜帶SV40基因。

注意事項：  收到細胞后第一次傳代建議1：2傳代，充液培養(yǎng)基是維持培養(yǎng)基，不能用來培養(yǎng)細胞。

細胞特性

1) 細胞來源于人正常子宮組織。

2) 細胞鑒定：細胞角蛋白（PCK）免疫熒光染色為陽性。

3) 經(jīng)鑒定細胞純度高于90%。

4) 不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌。

5) 細胞生長方式：上皮樣，多角形細胞，貼壁培養(yǎng)。
原代細胞分離培養(yǎng)的思路：

取材--分離--培養(yǎng)--鑒定

首先將組織從機體中取出，經(jīng)胰dan白酶/膠原酶處理后分散成單細胞，再在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞繁殖到一定系數(shù)后進行細胞鑒定。

實驗步驟：

一、取7-10d雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。

二、在超凈工作臺中，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中，去除小腦和間腦。

三、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以去除軟腦膜和腦膜大血管，再放在新的盛有預冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中。

四、用細解剖鑷去除大腦白質(zhì)、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質(zhì)。

五、大腦皮質(zhì)放于DMEM中，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶，0 .025-0 .05％IV型膠原酶，200-400U DNaseI)，混勻后37℃水浴消化1-1.5h。

六、室溫1 000×g離心8min，去上清液。

七、沉淀中加入20％BSA重懸浮，充分混勻，1 000×g，20min，4℃離心，去上清。

八、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶，0.05-0.1％I型膠原酶，100-300U DNaseI )重懸浮，混勻，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室溫離心6min，去上清液。

九、沉淀加入2ml DMEM培養(yǎng)液懸浮混勻，鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g，60min，4℃)，1000×g，4℃離心10min。

十、靠近底部的紅細胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段，吸出后DMEM漂洗兩次(離心1000×rpm，6min，室溫)，去上清液。

加入DMEM培養(yǎng)液(20％FBS，4ug/ml素 )重懸浮，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細胞培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h后更換不含素的混合培養(yǎng)基，隨后隔天換液。

注意事項：

1. 培養(yǎng)基于4℃條件下可保存3-6個月。

2. 在細胞培養(yǎng)過程中，請注意保持無菌操作。

3. 傳代培養(yǎng)過程中，yi酶消化時間不宜過長，否則會影響細胞貼壁及其生長狀態(tài)。

4. 建議客戶收到細胞后前3天每個倍數(shù)各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態(tài)，便于和技術(shù)部溝通；由于運輸?shù)脑?，個別敏感細胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請及時和我們聯(lián)系，詳盡告知細胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤、回訪直至問題得到解決。
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