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把控細胞凍存必看事項
閱讀：186 發(fā)布時間：2023-6-27細胞凍存是細胞保存的主要方法之一，也是保持細胞活性和增殖能力的重要手段。細胞可以通過被暫時休眠（凍存）， 等到需要時再被輕輕喚醒（復蘇）。低溫下，活細胞中的生物和化學反應都會大大降低，為細胞長期凍存提供了可能。冷凍對大多數活生物體都是致命的，細胞凍存是利用冷凍保護劑來降低冰點，緩慢凍結細胞的過程中，細胞內水分透出細胞，使細胞凍結中冰晶形成減少，從而避免了由于冰晶形成對細胞中生命活性物質的一系列損傷。細胞凍存時利用低溫降低細胞代謝，使細胞處于停止生長的“休眠"狀態(tài)，等需要使用的時候再進行復蘇操作。細胞儲存在-70℃冰箱中，可以保存一年；若儲存在-196℃的液氮環(huán)境中，理論上可以實現長期永存。
1、細胞凍存的常見方法
細胞凍存和復蘇的關鍵要點是慢凍快融。細胞凍存的效果主要與降溫步驟、凍存保護液的使用、凍存溫度、復溫速率及用于凍存的細胞生長狀態(tài)有關。降溫速率過快容易引起細胞內冰晶損傷，所以為防止細胞內結冰必須采用一個“慢"的降溫過程，并使用凍存保護劑，即凍存液。目前細胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜（DMSO）作保護劑。
根據降溫速度區(qū)分，細胞凍存可以分為程序降溫凍存與非程序降溫凍存。傳統的凍存方法是將冷凍管置于4℃ 30分鐘、-20℃ 30分鐘、-80℃過夜再轉液氮。這種凍存方法步驟多，而且需要遵守幾個時間點，容易被遺忘，對于繁忙的實驗人員而言不那么友好。而程序降溫方法，采用降溫速率-1℃～-2℃/min；當溫度達-25℃以下時，可增至-5℃～-10℃/min，再放至-196℃液氮保存。常規(guī)的程序降溫凍存方法較為復雜、費時，需要儀器設備花費較高，所以非程序降溫凍存方法便應運而生，它能大大簡化凍存流程，細胞可直接置于-80°C冰箱完成凍存過程，更為簡便高效。
2、 細胞凍存和復蘇的最佳時間
細胞在體外生長期間，通常分為三個階段：潛伏期、指數生長期和平臺期。潛伏期通常是細胞剛剛傳代，此時細胞開始貼附基質和伸展骨架，代謝活動集中在粘附蛋白和骨架蛋白的表達，細胞數量在這段時間內幾乎沒有增加。
隨后，細胞開始指數生長期，轉錄翻譯過程旺盛，胞內物質、信號傳遞迅速，細胞數量迅速增長。如果在這個時期凍存，實際上是強行將細胞凍結在代謝的某一時刻，勢必造成對解旋的DNA、轉錄翻譯中的RNA和蛋白的機械損傷，增加個別環(huán)節(jié)發(fā)生錯誤的風險。
隨著細胞數量的增長，培養(yǎng)容器內，細胞匯合達到90%以上。大部分細胞因為“接觸抑制"而停止高速代謝和增殖，胞內活動趨于平緩。所以，建議在剛剛進入平臺期時凍存細胞，既可以獲得足量的細胞，也不會對細胞造成過多的機械損傷。
3、細胞凍存的注意事項：
1. 為保持細胞最大存活率，一般都采用慢凍存融的方法。
2. 凍存物距液氮面越近溫度越低。標準的低凍速度為－1℃~12℃/ 分鐘，當溫度下降達－25℃時，下降速度可增至－5~－10℃/ 分鐘，到－100℃時則可迅速凍入液氮中。因此要適當掌握凍存物下降入液氮中的速度，過快能影響細胞內水分透出，太慢則促冰晶形成。
3. 初次凍存者在下降凍存時，宜先用細木棒伸入罐中探測液面位置，然后需用溫度計與凍存物并行的辦法，以觀測下降凍存物的速度、凍存物與液氮液面距離和溫度三者關系，當已掌握以上各參數和凍存技術熟練后，僅按下降時間和下降距離便可獲理想凍存效果。
4. 各種細胞對凍存速度的要求也不一樣；上皮細胞和成纖維細胞耐受性可能大些，骨髓干細胞－2~－3℃/ 分鐘合適；胚胎細胞耐受性較小，不宜太快?？傊谝婚_始時，下降速度不能超過－10℃/ 分鐘。
5. 用什么防護劑合適和用量多大，要依細胞而定，初代培養(yǎng)細胞用 DMSO 較好，一般細胞可用甘油；用量以較小為好。有人認為人皮膚上皮細胞貯存在 20%-30% 甘油中很好。
6. 原則上細胞在液氮中可貯存多年，但為妥善起見，凍存一年后，應再復蘇培養(yǎng)一次，然后再繼續(xù)凍存。
7. 將凍存管放入液氮容器或從中取出時，要做好防護工作，以免凍傷。
8. 注意自身的安全，對于來自人源性或病毒感染的細胞株應特別小心。操作過程中，應避免引起氣溶膠的產生，小心有毒性試劑例如 DMSO，并避免尖銳物品傷人等。