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cf DNA納米孔測序和甲基化檢測
循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）液體活檢是非?；钴S的研究領(lǐng)域，且已證明其是微創(chuàng)癌癥檢測和監(jiān)測的有力手段。在個(gè)性化疾病監(jiān)測中，細(xì)胞游離DNA（cfDNA）的表觀遺傳狀態(tài)也正成為一種有前景的生物標(biāo)志物，也可能被證明在癌癥篩查中具有價(jià)值1。納米孔測序技術(shù)能準(zhǔn)確靈敏地檢出低豐度的cfDNA和ctDNA2,3，且可直接從納米孔測序數(shù)據(jù)中檢測DNA甲基化，而無需在樣本制備過程中進(jìn)行相關(guān)轉(zhuǎn)化或擴(kuò)增。因此此技術(shù)平臺未來有望成為“液體活檢的強(qiáng)大工具"4,5。
此前，意大利佛羅倫薩癌癥研究和預(yù)防機(jī)構(gòu)ISPRO的Martignano團(tuán)隊(duì)，創(chuàng)新地采用Oxford Nanopore納米孔低深度全基因組測序（WGS）從癌癥液體活檢樣本中檢測拷貝數(shù)畸變（CNA），并發(fā)表了相關(guān)論文3。在此基礎(chǔ)上，該團(tuán)隊(duì)又與以色列耶路撒冷希伯來大學(xué)的Katsman團(tuán)隊(duì)開展合作。最近他們證明，液體活檢中cfDNA和ctDNA的Oxford Nanopore納米孔低深度全基因組測序（WGS）技術(shù)還可用于檢測cfDNA的細(xì)胞起源、癌癥相關(guān)片段標(biāo)記物和癌癥特異性甲基化特征，并且其結(jié)果與短讀長測序得到的數(shù)據(jù)集相當(dāng)5。Katsman團(tuán)隊(duì)總結(jié)了該平臺的優(yōu)點(diǎn)：[Oxford Nanopore Technologies]研發(fā)的測序技術(shù)操作簡單，一次測序就可獲得多種特征，測序儀成本低且便攜，因而在臨床研究領(lǐng)域很有價(jià)值5。
利用納米孔測序檢測甲基化非常吸引Katsman及其團(tuán)隊(duì)，因?yàn)閬喠蛩釟潲}WGS法存在樣本可能顯著降解和輸入材料損失，并可能難以確定片段規(guī)律等缺點(diǎn)。此外，亞硫酸氫鹽測序無法區(qū)分5mC和其他修飾，如5hmC、5fC和5CaC，而這些修飾原則上均可通過納米孔技術(shù)檢測到5。
Katsman團(tuán)隊(duì)僅基于cfDNA分析，使用納米孔測序并與對應(yīng)的短讀長WGS數(shù)據(jù)集進(jìn)行比較，估計(jì)了其樣本中癌細(xì)胞的比例。為更好理解低測序深度影響，該團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了降采樣實(shí)驗(yàn)，并且證明了當(dāng)納米孔WGS數(shù)據(jù)降采樣至0.2x平均覆蓋深度時(shí)，結(jié)果仍然一致。當(dāng)以更高的深度對短讀長文庫進(jìn)行測序時(shí)（中位數(shù)為1.3x），Oxford Nanopore的納米孔測序得到的腫瘤比例估計(jì)值與短讀長測序的結(jié)果極為相似。
他們還證明，Oxford Nanopore納米孔低深度全基因組測序（WGS）技術(shù)就可再現(xiàn)正常非癌細(xì)胞類型的構(gòu)成，而使用短讀長亞硫酸氫鹽法（WGBS）則需要更高的測序深度才能做到。
此外，Katsman團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，腫瘤比例更高的樣本，其片段大小也往往更短，因此，片段長度差異也可能用于區(qū)分癌癥類型5。采用Oxford Nanopore的測序技術(shù)，可對短片段進(jìn)行高效測序，同時(shí)也可比短讀長測序法更能捕獲到較長的cfDNA片段（如Yu等人6最近的報(bào)告）。
Katsman團(tuán)隊(duì)指出，雖然樣本規(guī)模小，但他們獲得的結(jié)果顯示，在DNA甲基化、片段化和CAN的癌癥特異性特征方面，納米孔測序數(shù)據(jù)與短讀長WGS和WGBS數(shù)據(jù)集之間大體一致。降采樣分析顯示，納米孔測序所需的基因組覆蓋度（至少0.2x），足以根據(jù)DNA甲基化特征檢測出所有樣本中癌癥衍生的DNA。
作者們還指出，他們其他相關(guān)工作表明，納米孔測序樣本制備快，測序快，可在1-3小時(shí)內(nèi)就對腫瘤DNA以甲基化為基礎(chǔ)進(jìn)行分類5。雖然他們沒有在自己的研究中測試過這種快速測序方法，但希伯來大學(xué)的高級研究員Ben Berman認(rèn)為，這是他們研究基于納米孔技術(shù)的液體活檢的最終目標(biāo)之一，即“在診療現(xiàn)場幾小時(shí)內(nèi)完成全面分析"7。
cf DNA測序：起始樣品<1 ng，無需PCR
盡管cfDNA分析領(lǐng)域發(fā)展迅速，但每毫升血漿只能提取單納克或更少的cfDNA仍然構(gòu)成一大瓶頸，因?yàn)闇y序通常需要數(shù)百納克的DNA。為解決這一難題，Lau及其同事們開發(fā)了一種無需PCR和亞硫酸氫鹽的Oxford Nanopore納米孔測序方法，以有效表征cfDNA的甲基化特征8。具體而言，該團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一系列操作步驟，將樣本條形碼和納米孔測序接頭有效地融入cfDNA，并系統(tǒng)地優(yōu)化反應(yīng)條件，以最大限度地提高cfDNA文庫產(chǎn)量。
“用這種無PCR方法，只需從每份樣本提取納克量或更少的cfDNA就可生成測序文庫8"
用他們的方法，每份cfDNA樣本可生成多達(dá)數(shù)億讀長，比現(xiàn)有方法提高了一個(gè)數(shù)量級。例如，用5 ng DNA可獲得約600萬個(gè)已比對和過濾的讀長，用100 pg DNA可獲得約140,000個(gè)比對讀長。
他們將其方法用于表征癌癥研究樣本的cfDNA甲基化組，并證明了在治療中使用這些特征進(jìn)行縱向監(jiān)測的潛力（圖1）。獲得的甲基化特征揭示了特異性治療反應(yīng)和耐藥性轉(zhuǎn)移癌的出現(xiàn)。
作者們在討論他們對本研究的長期愿景時(shí)得出結(jié)論：“這種方法有可能對癌癥檢測和表征的液體活檢診斷產(chǎn)生影響"8。
圖1：結(jié)直腸癌研究樣本中cfDNA的縱向甲基化特征?？俢fDNA讀長（上圖）和與對應(yīng)腫瘤匹配的甲基化特征讀長（下圖）。第400天后，具有腫瘤特異性甲基化變化的讀長片段比例顯著增加，這與腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)展相關(guān)。（圖來自Lau等人，2022年8）
“這項(xiàng)可行性研究表明，Oxford Nanopore低深度WGS技術(shù)可成為液體活檢的有力工具5"
參考文獻(xiàn)
Klein, EA. et al. Ann Oncol. 32:1167–77 (2021)
Marcozzi, A. et al. NPJ Genom Med. 6, 106 (2021)
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Yuen, ZW-S. et al. Nat Commun. 12:3438 (2021)
Katsman, E. et al. Genome Biology. 23:158 (2022)
Yu, SCY. et al. Proc Natl Acad Sci USA. 118. (2021)
Berman, B. Personal communication with Oxford Nanopore Technologies on 23 August 2022
Lau, BT. et al. bioRxiv. 497080 (2022)
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