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GC-MS/MS法一針測定植物性食品中 208種農(nóng)殘及代謝物
閱讀：1366 發(fā)布時間：2019-6-24前言：
中國是農(nóng)藥生產(chǎn)和使用大國，農(nóng)藥廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，同時農(nóng)藥濫用和不 規(guī)范使用現(xiàn)象比較普遍，所以在食品中農(nóng)藥殘留情況也是比較突出。日常檢 測中，農(nóng)殘檢測的任務(wù)也相當(dāng)繁重，當(dāng)前我國對于農(nóng)殘檢測的方法標(biāo)準(zhǔn)主要 集中在GC、GCMS等，隨著氣相色譜三重四極桿質(zhì)譜的普及，GC-MS/MS 的檢測方法以其高選擇性、高靈敏度、高通量特點越來越受檢測工作者的歡 迎，為此農(nóng)業(yè)部在2017年發(fā)布了《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 植物源性食品中208種 農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》（征求意見稿）。賽 默飛應(yīng)用團(tuán)隊基于此國標(biāo)方法，開發(fā)了應(yīng)對不同基質(zhì)中農(nóng)殘前處理方式，以 及配套的儀器方法和數(shù)據(jù)處理方法，以滿足農(nóng)殘檢測快速、準(zhǔn)確、高通量的 要求。
基于QuEChERS前處理技術(shù)，我們開發(fā)了上海青、大米、花生油、茶葉四 種具有代表性的樣品基質(zhì)的提取凈化方法，基于TSQ 9000的Time-SRM掃 描方式建立了一針檢測208種農(nóng)藥的儀器方法(Instrument Method)，依托 TraceFinder軟件開發(fā)了對應(yīng)的數(shù)據(jù)處理方法(Master Method)。對樣品基質(zhì)進(jìn) 行了不同濃度的加標(biāo)回收測算，經(jīng)過基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量計算，大部分的化合 物回收率在80-120%之間，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度在0.01-0.2 mg/kg范圍內(nèi)，所有 化合物的線性相關(guān)系數(shù)均在0.99以上，定量限都能做到0.01 mg/kg。
2. 儀器 氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀TSQ 9000 (賽默飛世爾科 技，美國)，Pesticides II 30 m×0.25 mm×0.25 µm with 5 m guard（PN：26RD142F）毛細(xì)管色譜柱。
3. 主要試劑和材料 3.1 乙腈（色譜純） 3.2 正己烷（色譜chun） 3.3 冰醋酸（分析純） 3.4 酸化乙腈（1:99）：取10 mL冰醋酸（3.3）加入到 990 mL乙腈（3.1）中，混勻 3.5 正己烷飽和的乙腈：取500 mL乙腈（3.1），往里加 入正己烷（3.2），直到有明顯分層 3.6 QuEChERS鹽包1（PN：60105-333-P）：含4 g硫 酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸氫二鈉 3.7 QuEChERS鹽包2（PN：60105-335-P）：含6 g無 水硫酸鎂、1.5 g醋酸鈉 3.8 QuEChERS凈化管1（PN:60105-218-P）：內(nèi)含 900 mg硫酸鎂、150 mg PSA及15 mg GCB的15 mL 塑料離心管 3.9 QuEChERS凈化管2（PN：60105-226）：內(nèi)含 1200 mg硫酸鎂、400 mg PSA、400 mg C18及400 mg GCB 的15 mL塑料離心管 3.10 QuEChERS凈化管3（PN：60105-225-P）：內(nèi)含 1200 mg硫酸鎂、400 mg PSA及400 mg C18的15 mL 塑料離心管
4 實驗部分 4.1 QuEChERS前處理方法 根據(jù)不同的樣品基質(zhì)類型，前處理有如下四種基本流程： 4.1.1 上海青（適用于蔬菜、水果和食用菌類） 稱取10 g已均質(zhì)好的試樣（至0.01 g）于50 mL塑 料離心管中，加入10mL乙腈（3.1），充分混勻后， 放入-20℃冰箱冷凍10 min，再加入4 g硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸氫二鈉等鹽包 （PN：60105-333-P），蓋上離心管蓋，劇烈震蕩1 min 后，9000 r/min離心6 min。吸取6 mL上清液到內(nèi)含900 mg 硫酸鎂、150 mg PSA及15 mg GCB的15 mL塑料離心管 中（PN: 60105-218-P）,渦旋混勻1 min, 9000 r/min離心 6 min，吸取1 mL上清液于進(jìn)樣瓶中，待上機(jī)測定。
4.1.2 大米（適用于谷物、油料和堅果類） 稱取5 g已粉碎的試樣（至0.01 g）于50 mL塑料離 心管中，加10 mL水渦旋混勻，靜置30 min。加入10 mL 1%醋酸乙腈溶液（3.4），充分混勻后，放入-20℃冰箱 冷凍10 min，再加入6 g無水硫酸鎂、1.5 g醋酸鈉等鹽包 （PN：60105-335-P），蓋上離心管蓋，劇烈震蕩1 min后 9000 r/min離心6 min。吸取6 mL上清液加到內(nèi)含1200 mg 硫酸鎂、400 mg PSA及400 mg C18的15 mL塑料離心管中 （PN：60105-225-P），渦旋混勻1 min。9000 r/min離心 6 min，吸取1 mL上清液于進(jìn)樣瓶中，待上機(jī)測定。
4.1.3 普洱茶（適用于茶葉和香辛料類） 稱取2 g已粉碎的試樣（至0.01 g）于50 mL塑料離 心管中，加10 mL水渦旋混勻，靜置30 min。加入10 mL 1%醋酸乙腈溶液（3.4），充分混勻后，放入-20℃冰 箱冷凍10 min，再加入6 g無水硫酸鎂、1.5 g醋酸鈉等鹽 包（PN：60105-335-P），蓋上離心管蓋，劇烈震蕩 1 min后9000 r/min離心6 min。吸取6 mL上清液加到內(nèi)含 1200 mg硫酸鎂、400 mg PSA、400 mg C18及400 mg GCB的15 mL塑料離心管中（PN：60105-226），渦旋混 勻1 min。9000 r/min離心6 min，吸取1 mL上清液于進(jìn)樣瓶 中，待上機(jī)測定。
4.1.4 花生油（適用于食用油類） 稱取2 g試樣（至0.01 g）于50 mL塑料離心管中， 加入10 mL正己烷飽和的乙腈（3.5），劇烈震蕩1 min后 9000 r/min離心6 min。吸取乙腈層加到內(nèi)含1200 mg硫 酸鎂、400 mg PSA及400 mg C18的15 mL塑料離心管中 （PN：60105-225-P），渦旋混勻1 min。9000 r/min離心 6 min，吸取1 mL上清液于進(jìn)樣瓶中，待上機(jī)測定。
4.2. 樣品基質(zhì)溶液： 選取空白樣品，用（4.1）前處理方式得到的空白基質(zhì)溶 液。
4.3. 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置 7.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液：在十萬分之一分析天平上稱取每種農(nóng) 藥單標(biāo)化合物10 mg，加入10 mL相應(yīng)的溶劑（根 據(jù)不同的化合物加入丙酮、甲苯或者乙腈）溶解， 配制成濃度為約1000 mg/L 的溶液。每種單個標(biāo)準(zhǔn) 儲備液的濃度根據(jù)稱樣量和加入溶劑的體積計算得 到。所有單標(biāo)儲備液在-20℃冰箱中冷凍保存。單標(biāo) 儲備液的有效期為6 個月。 7.2 混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：移取適量的單標(biāo)儲備液，用乙腈 稀釋。中間標(biāo)準(zhǔn)儲備液的濃度為10.0 mg/mL。中間 標(biāo)準(zhǔn)儲備液在-20 ℃冰箱中冷凍保存。中間儲備液的 有效期為3 個月。 7.3 工作標(biāo)準(zhǔn)溶液：取適量的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，以空白 樣品基質(zhì)液（6）依次稀釋成濃度為0.010, 0.020, 0.050, 0.100, 0.200 mg/L的工作標(biāo)準(zhǔn)溶液。
4.4 儀器方法 4.4.1氣相方法： 柱溫箱：40 ℃保持1.5 min，以25 ℃/min升至90 ℃，保 持1.5 min，再以25 ℃/min升至180 ℃，保持1.5 min，以 5 ℃/min升至 280 ℃，后以 10 ℃ /min 升溫到 300 ℃， 保持 5 min；SSL進(jìn)樣口：溫度270 ℃，進(jìn)樣模式：不分流 進(jìn)樣，不分流時間：1 min；載氣：恒流，1.2 mL/min.
4.4.2質(zhì)譜方法： 傳輸線溫度：280 ℃；離子源溫度為300 ℃；離子 源：E I；采集方式：Time-SRM；分辨率：F W H M 0.7Da(Q1和Q3)；化合物離子對信息來源于Thermo農(nóng)殘數(shù) 據(jù)庫CDB以及AutoSRM。
4.5 數(shù)據(jù)處理 使用 Thermo Scientific™ TraceFinder軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行采 集、處理和報告分析，該軟件可同時實現(xiàn)儀器控制、方法 開發(fā)、定量/ 定性分析以及報告編輯。此外，TraceFinder 軟件可以根據(jù)你所需要的信息自定義報告模板。
4.6 AutoSRM自動優(yōu)化化合物離子對信息及碰撞能量 對于串接氣質(zhì)來說，方法優(yōu)化及建立是非常重要的部分常規(guī)的方法開發(fā)需要對每個未知化合物挑選母離子，子離 子以及優(yōu)化碰撞能量，當(dāng)未知化合物越多，花費的時間也 就越多。賽默飛世爾科技全新一代三重四極桿氣相色譜質(zhì) 譜聯(lián)用儀TSQ 9000*的AutoSRM功能，可以自動優(yōu)化 離子對信息及碰撞能量，并且當(dāng)一次優(yōu)化的化合物數(shù)目較 多時，可以智能的調(diào)整進(jìn)樣的次數(shù)以期在少的時間內(nèi)得 到優(yōu)化的方法，使得整個方法建立部分更加簡單方便。 整個AutoSRM的步驟如下：
第三步：優(yōu)化碰撞能量，選擇full range或者Target模式進(jìn) 行SRM碰撞能量優(yōu)化，在出來的數(shù)據(jù)中，選擇響應(yīng)高處 的CE值為優(yōu)碰撞能量
5. 實驗結(jié)果及討論 5.1國標(biāo)方法定量限要求 208種農(nóng)藥針對不同的樣品基質(zhì)，定量限有所不同，總體 分布要求如下： a)蔬菜、水果、食用菌(0.01mg/kg) b)谷物、油料、堅果(0.01-0.02mg/kg) c)茶葉和 香辛料(0.01-0.05mg/kg) d)食用油(0.01-0.02mg/kg)
5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限 以4種樣品空白基質(zhì)配制0.010、0.020、0.050、0.100 、0.200 mg/L的混標(biāo)溶液，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)R2 均大于0.99。根據(jù)國標(biāo)的要求，定量限低的要求做到 0.01 mg/kg，茶葉基質(zhì)中混合農(nóng)藥的譜圖如圖1所示。在 本實驗方案中，所有化合物定量限能達(dá)到0.01 mg/kg，具 體樣品基質(zhì)中檢出限統(tǒng)計如圖2所示。該實驗方案的檢出 限水平遠(yuǎn)超國標(biāo)方法的要求
5.2回收率及穩(wěn)定性 根據(jù)4種樣品基質(zhì)，我們分別做了加標(biāo)回收率實驗，在特 定的加標(biāo)濃度下，大部分化合物回收率在80-120%之間， 回收率統(tǒng)計見表2。茶葉基質(zhì)中40ppb濃度的農(nóng)殘，連續(xù) 進(jìn)樣10針，RSD統(tǒng)計情況如圖3。
結(jié)論：
本實驗采用QuEChERS前處理方案，Thermo Fisher全新 一代三重四極桿質(zhì)譜TSQ 9000，同時配備Pesticide II色譜 柱分離，在Time-SRM的掃描方式下，讓儀器方法管理更 加智能方便，使208種農(nóng)藥及代謝物在36min內(nèi)一針完成 分析，基于TraceFinder軟件一站式的數(shù)據(jù)處理，一站式完 成208種農(nóng)殘的全流程分析檢測。該實驗室方案具有前處 理流程簡單、快速、準(zhǔn)確、有效，儀器操作簡便，方法性 能具有的靈敏度和出色的穩(wěn)定性的特點，*新 國標(biāo)對于農(nóng)殘檢測的要求。