南極熱敏UDG公司正在出售的產(chǎn)品：昆明白小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，經(jīng)mitomycin-C處理，P3,300萬細(xì)胞　TSK蛋白封閉多肽　刺激隱核蟲PCR檢測試劑盒　大鼠糖皮質(zhì)類固醇受體(GR)ELISA Kit　糖原磷化b（GPb）活性比色法檢測試劑盒　潮汐深海菌　卡爾曼綜合癥基因1抗體

商品屬性：

是來源于嗜冷海洋細(xì)菌經(jīng)大腸桿菌表達(dá)純化的的重組蛋白。
該酶能有效地水解單鏈或雙鏈DNA 上的niao嘧啶，產(chǎn)生的缺嘧啶位點，在高溫或高 pH下，極易水解斷裂。該酶對 RNA 無活性，主要用于 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的防污染。大腸桿菌來源的niao嘧啶-DNA 糖基化酶較為耐熱，經(jīng) 95℃10min 處理仍會殘留有少量的niao嘧啶-DNA 糖基化酶活性，導(dǎo)致含有 dU 堿基的 PCR 產(chǎn)物的降解。
而來源于嗜冷海洋細(xì)菌的熱敏型 UDG 在 50℃5min 即失活，在進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增前，在 PCR 混合液中添加niao嘧啶-DNA 糖基化酶（熱敏性），25℃ 2min 即可消除以往 PCR 產(chǎn)物的殘留污染，由于niao嘧啶-DNA 糖基化酶（熱敏性）在 PCR 循環(huán)的 94℃變性一步便可被滅活，因此不會影響新的含 dU 的 PCR 產(chǎn)物。

活性定義：在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系下，37°C 每分鐘催化 60 pmol niao嘧啶從含niao嘧啶的雙鏈 DNA 上釋放所需要的酶量為一個活性單位。
反應(yīng) Buffer：
ThermoLabile Uracil DNA Glycosylase (UDG)與絕大多數(shù)的 PCR 聚合酶反應(yīng)緩沖液都是兼容的，但在高離子濃度(>100 mM)下活性會受到抑制。在防污染 PCR 中的使用濃度推薦為 10 mU-50 mU/μ（l 25℃下作用 2min 即可），在不同的緩沖系統(tǒng)下可能會有差別。
酶儲存液：20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, ,50% Glycerol, 0.1% (w/v) Triton X-100, pH 7.5。
儲存：置于-20°C 可保存 2 年。
熱失活：50°C，5min。

沒有ct值

檢測結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));

2、PCR程序設(shè)置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解?？赏ㄟ^PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復(fù)凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴(kuò)增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴(kuò)增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實驗設(shè)計和目的進(jìn)行。

1、擴(kuò)增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計不合理, 需要重新設(shè)計;

2、PCR程序不合適, 改用三步法進(jìn)行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產(chǎn)物太長。PCR產(chǎn)物設(shè)計超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測或?qū)⒛０暹M(jìn)行稀釋。

PCR基本步驟及注意事項？

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴(kuò)增DNA的一種方法，它類似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應(yīng)同樣需要類似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設(shè)計的特定序列，實現(xiàn)對特定位置的擴(kuò)增；PCR Buffer提供一個反應(yīng)的緩沖環(huán)境；反應(yīng)過程同生物體內(nèi)一樣，DNA雙鏈打開，引物結(jié)合模板，延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應(yīng)溫度實現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈，在退火溫度處引物結(jié)合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復(fù)重復(fù)此過程即可實現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴(kuò)增。到第三循環(huán)開始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子，進(jìn)一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應(yīng)。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增，達(dá)到較高水平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺期前結(jié)束反應(yīng)， 減少非特異性產(chǎn)物。到達(dá)平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物，cDNA等，但不能為RNA。對于不同類型的模板，其主要不同在于預(yù)變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預(yù)變性時間10min足夠，質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結(jié)合，合成另一條鏈。從第二輪開始，兩個引物均與特異位點結(jié)合，從而實現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增，原因就在于實現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶，只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說，一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響，故需對提取的DNA進(jìn)行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴(kuò)增。對于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡單，且提取濃度一般較低，則無需稀釋。

公司正在出售的產(chǎn)品：