瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒 ( 磁珠法）公司正在出售的產(chǎn)品：人肺腺癌細胞GFP熒光穩(wěn)轉株　ERV31包膜蛋白封閉多肽　馬隱秘桿菌PCR檢測試劑盒　大鼠抗紅細胞抗體(RBC) ELISA檢測試劑盒　β半乳糖苷（βGAL）活性比色法檢測試劑盒　點枝頂孢　葡萄糖果糖還原2抗體

商品屬性：

保存條件：本試劑盒在室溫儲存12個月不影響使用效果。

產(chǎn)品介紹：

  瓊脂糖凝膠電泳是一種用于分離純化DNA片段的重要分子生物學實驗技術。本試劑盒中的溶膠液可以溶解由TAE或TBE電泳緩沖液制備的瓊脂糖凝膠塊，從凝膠塊中溶解的DNA片段可以特異性地吸附到硅基化磁珠的表面，在磁場的作用下，攜帶DNA的磁珠向磁鐵方法進行定向移動和聚集，與剩余的其它雜質分開。通過簡單的兩次洗滌，可以將雜質洗盡。最后用水或低鹽緩沖液將結合在磁珠上的DNA洗脫下來，純化的DNA可用于測序、酶切、標記和克隆等多種下游實驗。該試劑盒可與核酸提取儀等工作站配套使用，可以簡單、快速地進行大規(guī)模核酸提取，達到降低工作量和提高工作效率的目的。

產(chǎn)品特點：

1.磁珠之間吸附量差異極小，可重復性好。

2.使用了優(yōu)質溶膠液，不含傳統(tǒng)溶膠液的碘鈉和高氯酸鹽，不影響后續(xù)下游實驗。

3.溶膠液為黃顏色，便于觀察溶膠效果和監(jiān)測pH值變化從而達到最佳結合效果，大大提高回收效率。

自備儀器及試劑：小型離心機、水浴或金屬浴加熱塊、磁力架()、震蕩器、無水乙醇

PCR基本步驟及注意事項？

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法，它類似于生物體內(nèi)DNA的復制。在生物體內(nèi)DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應同樣需要類似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列，實現(xiàn)對特定位置的擴增；PCR Buffer提供一個反應的緩沖環(huán)境；反應過程同生物體內(nèi)一樣，DNA雙鏈打開，引物結合模板，延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應溫度實現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈，在退火溫度處引物結合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復重復此過程即可實現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環(huán)開始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子，進一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

在擴增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴增的反應變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴增，達到較高水平。因此，應適當調節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺期前結束反應， 減少非特異性產(chǎn)物。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物，cDNA等，但不能為RNA。對于不同類型的模板，其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠，質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產(chǎn)物預變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結合，合成另一條鏈。從第二輪開始，兩個引物均與特異位點結合，從而實現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增，原因就在于實現(xiàn)PCR反應的是DNA聚合酶，只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說，一般25ul體系DNA的質量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響，故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質粒及PCR產(chǎn)物由于其結構簡單，且提取濃度一般較低，則無需稀釋。

PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準);

2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解?？赏ㄟ^PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準確。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實驗設計和目的進行。

1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優(yōu)化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產(chǎn)物太長。PCR產(chǎn)物設計超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。

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