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貼壁細(xì)胞培養(yǎng)常見問題分析及解決方法!
貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)要貼附于培養(yǎng)(瓶)器皿壁上,細(xì)胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展,然后開始有絲分裂,并很快進(jìn)入對數(shù)生。貼壁細(xì)胞因其培養(yǎng)過程較為繁瑣,所以培養(yǎng)時(shí)更容易出現(xiàn)問題。BUNSEN本生小編總結(jié)了貼壁細(xì)胞培養(yǎng)中常見問題,并詳細(xì)介紹原因和解決方法,若培養(yǎng)時(shí)遇到這些情況,可參考對應(yīng)解決方法處理。
一、貼壁細(xì)胞培養(yǎng),細(xì)胞不貼壁
常見原因:胰蛋白酶消化過度;支原體污染;培養(yǎng)基pH值過堿(NaHCO3分解);細(xì)胞老化;接種細(xì)胞起始濃度太低或太高。
解決方法:縮短胰蛋白酶消化時(shí)間或降低胰蛋白酶濃度;分離培養(yǎng)物,檢測支原體。清潔支架或培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染,丟棄培養(yǎng)物;使用無菌醋酸溶液調(diào)整pH值或充入無菌CO2;啟用新的保種細(xì)胞;調(diào)節(jié)接種細(xì)胞濃度。
二、培養(yǎng)細(xì)胞生長緩慢
常見原因:由于更換不同培養(yǎng)液或血清;培養(yǎng)液中一些細(xì)胞生長必須成分如谷氨酰胺或生長因子耗盡或缺乏或已被破壞;培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染;試劑保存不當(dāng);接種細(xì)胞起始濃度太低;細(xì)胞已老化;支原體污染。
解決方法:比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分,比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn),讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液;換入新鮮配置培養(yǎng)液,或補(bǔ)加谷氨酰胺及生長因子;用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng),如發(fā)現(xiàn)污染,丟棄培養(yǎng)物;血清需保存在-10到-20℃。培養(yǎng)液需在2-8℃避光保存。含血清培養(yǎng)液在2-8℃保存,需在1周內(nèi)用完;增加接種細(xì)胞起始濃度;換用新的保種細(xì)胞;分離培養(yǎng)物,檢測支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染,丟棄培養(yǎng)物。
三、細(xì)胞生長周期變慢,邊養(yǎng)邊漂
常見原因及解決方法:
1、細(xì)胞傳代時(shí)密度太稀或太密:建議細(xì)胞密度達(dá)80%左右進(jìn)行傳代,傳代密度適中,密度過低會延長生長周期;
2、傳代操作不當(dāng):根據(jù)細(xì)胞特性決定細(xì)胞消化時(shí)間,一般在顯微鏡下觀察細(xì)胞回縮變圓并有少量細(xì)胞脫落即可終止消化,難消化的細(xì)胞可分次消化,每次時(shí)間不超過5min;頻繁換液或者清洗細(xì)胞也會導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)變差,常規(guī)換液時(shí)間間隔為2~3天。
四、傳代后部分細(xì)胞漂浮
常見原因及解決方法:
1、傳代細(xì)胞密度太大:一般細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)可進(jìn)行傳代操作,傳代密度需適中,傳代密度過高也會導(dǎo)致傳代后漂浮;
2、細(xì)胞狀態(tài)不好:可通過提高血清比例、穩(wěn)定培養(yǎng)環(huán)境等方法進(jìn)行改善;
3、吹打次數(shù)過多造成機(jī)械損傷:輕柔吹打,細(xì)胞呈單顆粒時(shí)可停止吹打,吹打過程避免氣泡產(chǎn)生;
4、培養(yǎng)基更換后不適應(yīng):更換回原來的培養(yǎng)基;或者與原培養(yǎng)基比例混合后使用,使細(xì)胞有個(gè)適應(yīng)期。
五、傳代后細(xì)胞全部飄起
解決方法:檢查所使用的培養(yǎng)基的顏色是否偏紫色,檢查瓶蓋是否透氣,不透氣瓶蓋是否被擰松。
通常培養(yǎng)基偏堿,顏色就會偏紫,主要是因?yàn)榕囵B(yǎng)基里的酚紅指示劑遇酸變黃、遇堿變紫,培養(yǎng)基量太少,或培養(yǎng)基存放時(shí)間太長時(shí)都會變堿。建議配好培養(yǎng)基后分裝到50mL離心管并于一周內(nèi)用完,量少時(shí)放到15mL離心管里保存。
六、傳代后細(xì)胞成團(tuán)
解決方法:
1、低密度接種,延長換液時(shí)間,防止細(xì)胞脫落;
2、使用多聚賴氨酸包被培養(yǎng)器皿,以增加細(xì)胞貼壁牢固度,降低細(xì)胞聚集成團(tuán)的幾率;
3、重新鋪板,并更換新配制的培養(yǎng)基,加大血清比例(增加比例不超過5%);
4、接種時(shí),減少培養(yǎng)基量(如T25加3mL)以加快細(xì)胞貼壁速度,等待細(xì)胞貼壁后(約8-12小時(shí)),再補(bǔ)加培養(yǎng)基到正常用量。
七、傳代后細(xì)胞變形
原因及解決方法如下
1)變形,但細(xì)胞還在生長:可能是血清批次不一樣導(dǎo)致,血清成分復(fù)雜,不同批次和品牌間均存在成分差異,影響細(xì)胞狀態(tài)。建議使用同一批次血清,更換血清時(shí)需與原血清比例混合后使用,使細(xì)胞有過渡期;
2)變形,但細(xì)胞不長,且碎片增多:可能傳代操作過程損傷,常見于消化不當(dāng),或者潛在支原體等污染導(dǎo)致細(xì)胞病態(tài);消化時(shí)間根據(jù)每個(gè)細(xì)胞的狀態(tài)來調(diào)整,消化過度或者消化不充分均會對細(xì)胞造成影響;培養(yǎng)過程應(yīng)嚴(yán)格無菌操作,實(shí)驗(yàn)環(huán)境盡量潔凈,確保細(xì)胞無外源污染。
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