ELISA實驗：哪些因素會導致ELISA實驗的假陽性

　　ELISA法對IgG、IgM都有很好的檢測能力，因其靈敏度高，價格低廉，操作方便，結果客觀，在實驗室廣泛應用，但在工作中遇到的zui大的問題是出現(xiàn)假陽性的問題。影響因素除了方法學、試劑盒本身之外,還有標本處理、操作不當?shù)榷喾N因素，雙試劑兩組結果進行配對t檢驗，差異(P>0.05)均無統(tǒng)計學意義。

　　多種因素可能會導致ELISA法本底偏高。出現(xiàn)灰值，除了嚴格操作、做好質控外，對可疑假陽性的標本一定要認真復測。為避免假陽性結果的出現(xiàn)現(xiàn)將產生假陽性的原因分析如下：

　　1、內源性因素

　　(1)年齡因素

　　老年人容易出現(xiàn)免疫功能異常，產生一些異常蛋白質干擾了檢測的結果出現(xiàn)假陽性。

　　(2)疾病因素

　　類風濕關節(jié)炎、紅斑狼瘡、糖尿病、自身免疫性疾病等可使患者體內含有嗜異性抗體，自身抗體、類風濕因子等，這些特殊成分在反應過程中有一定的吸附作用，多為體內某些抗原物質干擾所致產生假的顯色反應而出現(xiàn)假陽性。

　　2、標本因素

　　(1)標本處理不chedi

　　血液抽出后未wan全凝固而離心分離血清不能使纖維蛋白原wan全析出，加樣后板孔中形成纖維蛋白薄膜或絮狀物，造成洗板不che底干凈，酶殘留在反應孔中，使反應孔吸光度值偏高，出現(xiàn)假陽性，待測血清中混有纖維蛋白原，這種物質易沉淀或附著在聚乙烯空內不易洗凈，試驗表明在較高的離心轉速(3000/min)和較長的離心時間(>10/min)之上，血液標本被充分地離心分離后，使紅細胞和纖維蛋白充分沉淀，可以在加樣時避免加入這兩種干擾物質對試驗結果的影響。

　　(2)標本溶血

　　標本溶血時細胞內液的各種活性酶以及具有酶活性的物質與底物非特異性結合，洗滌時不易洗去，催化底物產生一定的顯色反應，使本底吸光度值偏高形成假陽性。

　　(3)細菌污染

　　標本放置、處置不當被細菌污染，一些細菌體內可能含有內源性辣根過氧化物酶會對相應的酶做標記的測定方法產生非特異性干擾，造成弱的假陽性反應。

　　3、操作因素

　　聚苯乙烯因其具有較長的吸附蛋白質的性能而被廣泛用于ELISA試驗的固相載體，聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，因此需要通過洗滌清楚在反應過程中，非特異性地吸附于固相載體的干擾物質，洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應步驟，但卻決定著試驗的成敗，可以在加樣前離心時得以控制，BUNSEN本生試劑盒 同樣也可以通過適當增加洗滌的次數(shù)和浸泡時間減輕或避免對試驗結果的影響，同樣對于血液存在的非特異性的lgG的樣本很難在加樣時將其去除，那么解決的時機就是洗滌過程。

　　(1)加樣太快，加樣時加在孔壁上或有氣泡。

　　(2)底物液反復使用被污染或被強光照射時間過長。

　　(3)板要平整，尤其是在洗板機洗板的過程中,往往是3排一起洗，如果板不平,就很可能造成洗液有殘留，從而導致非特異性結合不能清除干凈，對實驗結果造成干擾。

　　(4)洗液溫度 實驗表明:洗液溫度也會影響洗板的干凈程度，尤其是冬天溫度過低時容易出現(xiàn)“花板"問題，因此，需保持在室溫在20-30℃。

　　洗液未注滿孔，孔壁洗滌不干凈也易造成假陽性現(xiàn)象。

　　(5)洗液要新鮮配置，洗液要臨用前新鮮配置，放置時間過長易產生絮狀物或渾濁，造成賭孔導致假陽性。

　　洗板次數(shù)不夠或洗滌間隔時間過短也會造成由于洗板不凈而造成假陽性，孵育時間過長也會造成假陽性;由于樣本較多，加樣后未及時放入孵育箱，反應板在室溫呆的時間過長，既間接增加了孵育時間，導致孵育時間過長。

　　4、儀器因素

　　(1)酶標儀是垂直對反應孔比色，反應孔底部污染時，出現(xiàn)反應孔吸光度值偏高。

　　(2)洗板拖尾現(xiàn)象，洗板機在洗板過程中，出水針出水不暢，滴滴答答不間斷出現(xiàn)水滴，造成板上水過多，拍板不干凈。

　　5、方法學因素

　　(1)廠家試劑盒，BUNSEN本生試劑盒 由于不同廠家的診斷試劑所包被的抗原配比以及抗原純度不盡一致，造成靈敏度和特異性不同，因此也造成了假陽性的產生。三代免疫試劑盒只檢測抗體，被某些身體不明抗原干擾，導致的假陽性。

　　(2)實驗灰區(qū)，在陽性與陰性之間有一條明顯的分界線，作為陽性判定值(cutoff)來判定結果，一般把檢測值S/COV值在0.6-1范圍內時作為灰區(qū)帶，因此當1

　　(3)“鉤狀效應"的產生，需對標本進行稀釋重復檢測。

　　(4)酶標儀的波長選擇，建議酶標儀比色時選擇雙波長，即敏感波長(主波長)和非敏感干擾波長(次波長)，zui后從儀器上得到的讀數(shù)為敏感波長與非敏感干擾波長之差，排除(板孔的劃痕、污跡)干擾。

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