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血清干貨分享:胎牛血清使用中會出現(xiàn)哪些問題
常見問題:
如何儲存和解凍胎牛血清?
胎牛血清中為什么會產(chǎn)生絮狀沉淀?如何避免?
胎牛血清的熱滅活?
細(xì)胞培養(yǎng)中出現(xiàn)黑點該怎么做?
小牛血清和胎牛血清有何區(qū)別?
1、如何儲存和解凍血清才不會使產(chǎn)品質(zhì)量受損?
將血清從冷凍箱取出后,先置于2~8℃冰箱使之融解,然后在室溫下使之全融。但必須注意的是,融解過程中必須規(guī)則地?fù)u晃均勻。
長時間儲存在2-8℃時,血清中的各種蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。因此,推薦在-20℃以下儲存血清,并避免反復(fù)凍融。
我們建議血清應(yīng)保存在-2O℃。若存放于4℃時,請勿超過一個月。若一次無法用完一瓶,建議無菌分裝血清至恰當(dāng)?shù)臏缇萜鲀?nèi),再放回冷凍。
2、血清中包含絮狀沉淀,它們是什么,怎么處理?
沉淀包含纖維蛋白和脂蛋白。這是正常特性,不會影響產(chǎn)品性質(zhì)。要除去沉淀,離心血清(400g,1-2分鐘)或者簡單的讓其沉淀在瓶子底部,將血清小心的轉(zhuǎn)移到另一個無菌瓶里(一般不建議采用過濾的方法除去沉淀,因為沉淀會堵塞濾膜而無法過濾)。大多情況輕輕搖動沉淀并加熱至37℃就會再溶解。所以,使用產(chǎn)品時要搖動并加熱血清至37℃,沉淀會自然消失。
3、如何避免血清中產(chǎn)生沉淀?
按如下操作可避免沉淀的產(chǎn)生:
(1)解凍血清時,請隨時將之搖晃均勻,使溫度及成分均一,減少沉淀的發(fā)生。
(2) 血清分裝凍存時,須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡),使溫度與成分均一。
(3) 勿直接由-20℃直接至37℃解凍,因溫度改變太大,容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀。
(4) 勿將血清置于37℃太久,否則血清會變得渾濁,同時血清中許多較不穩(wěn)定的成份也會因此受到破壞,從而影響血清的品質(zhì)。
(5) 血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多,若非必要,可以無須做此步驟。
(6) 若必須做血清的熱滅活,請遵守56℃,30分鐘的原則,并且隨時搖晃均勻。溫度過高,時間過久或搖晃不均勻,都會造成沉淀物的增多。
4、培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后,可長期保存嗎?
一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時,您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。
5、為什么要熱滅活血清?
加熱可以滅活補體系統(tǒng)。激活的補體參與溶解細(xì)胞事件,刺激平滑肌收縮,細(xì)胞和血小板釋放組胺,激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在免疫學(xué) 研究,培養(yǎng)ES細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞時,推薦使用熱滅活血清。
6、有必要做熱滅活嗎?
實驗顯示,經(jīng)過正確處理的熱滅活血清,對大多數(shù)的細(xì)胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過的血清對細(xì)胞的生長只有微小的促進(jìn),或沒有任何作用,甚至通常因為高溫處理影響了血清的質(zhì)量,而造成細(xì)胞生長速率的降低。
而經(jīng)過熱處理的血清,沉淀物的形成會顯著的增多,這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察,像是“小黑點",常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染,而把血清放在37℃環(huán)境中,又會使此沉淀物更增多,使研究者誤認(rèn)為是微生物 的分裂擴(kuò)增。
若非必須,可以不需要做熱處理這一步。不但節(jié)省時間,更確保血清的質(zhì)量!
7、細(xì)胞培養(yǎng)中出現(xiàn)黑點是污染嗎?如何處理?
一旦您在細(xì)胞培養(yǎng)的過程中發(fā)現(xiàn)有黑點生成,首先,要肉眼觀察培養(yǎng)基是否混濁,然后,在鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞生長的狀態(tài),黑點是否游動。如果細(xì)胞被污染,微生物則會大量繁殖,培養(yǎng)基就會迅速變黃、變混濁。污染包括細(xì)菌污染、支原體污染等。
如果在鏡下觀察細(xì)胞,生長狀態(tài)良好,與黑點出現(xiàn)前相比,沒有任何變化,那么,黑點的出現(xiàn)可能與以下幾種情況有關(guān):
(1)細(xì)胞生長過老,破碎的細(xì)胞殘骸;
(2)血清質(zhì)量不好,反復(fù)凍融的結(jié)果;
(3)配制培養(yǎng)基的pH值偏高,不宜細(xì)胞生長;
(4)配制培養(yǎng)基的水質(zhì)、容器不合格??蓱?yīng)用離心、過濾的方法去除這些黑點;
(5)培養(yǎng)原代細(xì)胞中出現(xiàn)小黑點,可能是原代組織中的雜質(zhì),多次傳代可以消除。
8、細(xì)胞培養(yǎng)中如何防止黑點生成?
(1) 盡可能地減少血清凍融次數(shù)。
(2) 培養(yǎng)基無需37℃水浴。
(3) 培養(yǎng)基保持最佳PH值7.0-7.2。
(4) 嚴(yán)格控制配制培養(yǎng)基的水質(zhì),容器定期刷洗。
(5) 掌握細(xì)胞傳代的最佳時機(jī),細(xì)胞切勿生長過老。
9、小牛血清和胎牛血清有何區(qū)別與注意事項?
(1)來源不同:胎牛血清(Fetal Bovine Serum ,FBS) 是在屠宰懷孕母牛的時候,通過心臟穿刺采血獲取的胎牛的血清,新生牛(小牛)血清(Calf serum, CS)采自出生10至14 天的小牛。
(2)組份與比例不同:兩者所含的促細(xì)胞生長因子、促貼附因子、激素及其他活性物質(zhì)等
(3)用途與用法不同:某些細(xì)胞必需胎牛血清才能生長,而有些細(xì)胞只需小牛血清即可,使用濃度不同,一般在5%-10%,有特殊要求的濃度在20%。
10、血清保存和使用須注意
血清應(yīng)保存在-5℃至-20℃,若存放在4℃不可超過一個月。
解凍血清時 ,應(yīng)先將血清至于2-8℃冰箱,并經(jīng)常搖勻使之溶解,然后至室溫放置使之升溫,絕對不可將冷凍的血清直接放入37℃水浴或者溫箱中,如放在37℃解凍,顏色加深,粘稠度也會增加,血清在解凍和熱滅活后,應(yīng)按用量分裝并于-20℃保存,避免反復(fù)凍融。
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