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1.制備培養(yǎng)濾液

搖好的培養(yǎng)液，細胞篩過濾去菌絲球，離心去細小菌絲 ，0.22uM過濾去細小顆粒。

2.超濾濃縮、更換buffer

1）新買的超濾管使用Milli-Q 水進行預(yù)清洗。定角轉(zhuǎn)子，使超濾內(nèi)管的膜面朝上，膜與軸垂直。加入蛋白液前，超濾管需要插在冰上預(yù)冷。

2）脫鹽或更換緩沖液是從含有生物分子的溶液中去除鹽分或溶劑的重要方法。鹽分去除或緩沖液的更換可通過超濾管來完成。

上超濾柱之后4度離心，離心時間很長，協(xié)調(diào)好離心機。4度，5000g，每半小時查看離心狀況。

濃縮至1 ml輕輕加入新的Buffer（經(jīng)0.22um超濾膜過濾），再濃縮至1ml。

該過程可反復(fù)進行，直到雜質(zhì)的濃度被充分降低。3-5次后基本更換buffer成功。一般不多于500ul，也有濃縮至200ul以內(nèi)的情況。

3）取出最終蛋白濃縮液的操作在冰上操作，用黃槍頭（200ul）取，順著邊緣插入槍頭，輕輕吹打、混勻蛋白液，注意不要碰到超濾膜，然后吸取濃縮液，每次吸接近200ul，直到吸完。

4）處理超濾管，重復(fù)利用超濾管

倒出超濾管里的水，用milliQ水輕輕潤洗幾次，若管底有可見的蛋白沉淀，先加入水，然后用槍頭輕輕吹打，然后倒掉。然后加入0.2M的NaOH溶液，室溫放置20min，用MilliQ水洗干凈，放4度保存，直到下次使用。一般來說，每根管用三四年不會壞。