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在生產(chǎn)消費品時，有效地清潔生產(chǎn)設備對質(zhì)量控制來說至關重要。清潔工藝的目標是降低產(chǎn)品污染的風險，有效的清潔工藝可以將風險降低到可接受的水平，以確保產(chǎn)品質(zhì)量。如果無法衡量和驗證清潔工藝的有效性，就無法了解產(chǎn)品質(zhì)量和消費者安全的風險。

總有機碳（TOC）分析是消費品生產(chǎn)商廣泛采用的非專屬方法，用于檢測產(chǎn)品、清潔劑、以及微生物等污染物的殘留量。

為了證明TOC分析法適用于預期用途，我們對設備清潔之后可能尚存的殘留物進行了回收和線性研究。工廠通常會測試化學污染物和化合物，但很少用TOC分析法來測試微生物的回收率。本文旨在探討對于清潔驗證和確認，TOC分析法能否證明可接受的微生物污染回收率和線性。

我們同科羅拉多大學博爾德分校合作，用一整夜時間在胰酶大豆肉湯中培養(yǎng)100毫升枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。以4500轉/分鐘的速度將最終培養(yǎng)物的十毫升等分試樣離心分離10分鐘，形成細胞沉淀。

在每次離心之間，倒出上面的液體，用渦旋混合方法用10毫升超純水使沉淀細胞重新懸浮。重復此過程7次。設計淋洗循環(huán)以除去細胞培養(yǎng)基帶來的TOC污染。在第7次淋洗循環(huán)后，根據(jù)已有的4,6-二氨基-2-苯基吲哚（4,6-diaminidino-2-phenylindole，DAPI）染色任務來對細胞進行重新懸浮、稀釋、計數(shù)（見圖1）。

圖 1：枯草芽孢桿菌在細胞計數(shù)的熒光顯微鏡成像

確定細胞密度之后，用Sievers® M9 TOC分析儀測量1 ppm確認標樣組，然后進行三次細胞濃度稀釋。在測量TOC之后，用0.45 μm滅菌過濾器過濾剩余樣品，除去細菌（見圖2）。然后再次測量TOC以確定每個樣品的非細胞背景TOC（見圖2）。

圖2：枯草芽孢桿菌的過濾過程

表 1：微生物細胞密度與TOC的相關性結果

圖 3：微生物細胞密度與TOC的線性關系

在進行微生物TOC定量之后，分別將1毫升的每種細胞密度溶液放在不銹鋼試樣板上進行試樣污染，然后使試樣干燥。此試樣污染的目的是確定微生TOC相關結果的目視檢測限。圖4是微生物試樣污染圖。

圖 4：微生物試樣板污染

微生物TOC相關結果和試樣污染圖都說明了連續(xù)監(jiān)測已有的清潔工藝有效性的重要性。在理想光線下，很容易在試樣板上看到最高細胞密度（5.8E+07細胞/mL）的污染斑。而對于較低細胞密度，即使光線很好，也很難在試樣板上看到污染斑。這表明除了強有力的清潔工藝之外，還需要用非目測的方法來測試清潔工藝的有效性。

根據(jù)收集的數(shù)據(jù)，可以想象用于生產(chǎn)消費品的設備上仍有顯著微生物污染，卻僅憑目視檢查就被投放到生產(chǎn)中，導致嚴重后果。因此必須連續(xù)監(jiān)測已有的清潔工藝的有效性，才能降低產(chǎn)品質(zhì)量風險和消費者安全風險。

最后，由于微生物分子組成的不確定性，很難確定微生物溶液的回收率。本研究根據(jù)先前在確定活性微生物細胞中的碳含量時的發(fā)現(xiàn)，旨在確定微生物溶液的理論回收率。圖5是理論微生物TOC產(chǎn)出量的計算過程?；诿總€細胞的碳原子參考數(shù)，5.8E+07細胞/mL的理論TOC濃度為11.6 ppm。

圖 5：理論微生物 TOC 產(chǎn)出量的維度分析

在本文的實驗中，測量到5.8E+07細胞/mL的TO實際回收值為9.13 ppm，對挑戰(zhàn)性的化合物的回收率為78.7%，從而證明實驗方法是成功的。

1. Recall Index and Spotlight. Expert Solutions

2. DAPI Protocol For Fluorescence Imaging Thermo-Fisher Scientific – US

3. Phillips, Rob, and Ron Milo. “A Feeling for the Numbers in Biology." Proceedings of the National Academy of Sciences 106, no. 51 (December 22, 2009): 21465.