iElisa 恩諾沙星檢測試劑盒

iElisa 恩諾沙星檢測試劑盒

1. 概要 本試劑盒是應用 ELISA 技術研發(fā)的藥物殘留檢 測產品,與儀器分析技術比較，能經濟、快速地檢測 出蜂蜜、雞肉、魚蝦、肝臟等中的恩諾沙星。 2、原理 本試劑盒是利用競爭 ELISA 方法，在酶標板微 孔上預包被抗 恩諾沙星抗原。檢測時，加入標準 品或樣品溶液，恩諾沙星抗體及酶標記物，包被抗 原和加入樣本中的恩諾沙星競爭性地與恩諾沙星 抗體結合后，再與酶標記物形成抗原抗體復合物， 用 TMB 底物顯色；加入反應終止液，在 450nm 波 長酶標儀下進行檢測，樣品中的恩諾沙星濃度與吸 收光強度成反比。 與類似物的交叉反應率： 恩諾沙星……………………………100% 環(huán)丙沙星……………………………3.4% 諾氟沙星……………………………6.3% 沙拉沙星……………………………2.5% 其它沙星類藥物交叉反應率均小于 0.1% 2. 試劑盒組成 酶標板 1 塊，96 孔/板 標準液 6 瓶（1ml/瓶）： 0 ppb 、0.5ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb 抗體工作液 ………………………7ml 酶標記物 …………………………7ml 底物液 A …………………………7ml 底物液 B …………………………7ml 終止液 …………………………7ml 20X 濃縮洗滌液 ………………40 ml 2X 濃縮復溶液 ………………50 ml 說明書 ……………………………1 份 4. 需要的儀器、試劑 （1）設備 ……微孔板酶標儀(450nm) ……振蕩器、離心機 ……微量移液器：20μl～200μl,100μl~1000μl ……容量瓶：100ml，500ml，1000ml （2）試劑 ……二氯甲烷、乙腈、NaOH、Na2HPO4.12H2O、 NaH2PO4.2H2O、正己烷 樣本前處理需配制： 配液 1：pH7.2 0.05M PB 緩沖液 稱取 12.9gNa2HPO4•12H2O，2.175gNaH2PO4• 2H2O 去離子水 1L 溶解。 配液 2：乙腈-0.1M HCL 溶液 V 乙腈：VHCL＝ 84：16 配液 3：正己烷-二氯甲烷混合溶液 V 正己烷：V 二氯甲烷 =2：8 配液 4：復溶工作液 2X 濃縮復溶液在使用前請按 1：1 稀釋 （1 份濃縮復溶液+1 份去離子水） 配液 5：洗滌液 將 40ml 濃縮洗滌液（20 倍濃縮）用去離子水稀釋 20×濃縮洗滌液在使用前請按 1：19 稀釋（1 份濃 縮洗滌液+19 份去離子水）（可按需配置） 5. 樣品處理 樣本處理前須知 處理任何樣本時，都須注意： （1）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的 試劑時要更換吸頭。 （2）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必 須使用潔凈實驗器具，以避免污染干擾實驗結果。 樣本處理步驟： (A)魚、蝦和雞肉（樣本稀釋倍數(shù) 2） （1）稱 2.0±0.05g 均質過的組織樣本于 50ml 離心 管中； （2）加入乙腈-0.1M HCL 溶液 4ml，充分振蕩 5 分 鐘，再加入正己烷-二氯甲烷混合溶液 4ml，振蕩 5 分鐘，室溫 4000 轉/分，離心 10 分鐘； （3）取 2ml 清澈上層有機相至干凈玻璃試管中， 56℃水浴氮氣/空氣吹干； （4）加 1ml 正已烷振蕩 30 秒，再加入 1ml 復溶工 作液充分振蕩混合 30 秒；室溫 4000 轉/分，離心 5 分鐘； （5）去除上層有機相，取下層 50µl 液體用于分析(B)蜂蜜（樣本稀釋倍數(shù) 2） （1）稱取 1±0.05g 蜂蜜于 50ml 離心管中，加 6ml 乙腈-0.1M HCL 溶液振蕩至蜂蜜全部溶解； （2）加入 3ml 0.05M PB 緩沖液，再加入 11ml 二 氯甲烷，振蕩 5 分鐘，室溫 4000 轉/分，離心 5 分 鐘； （3）去除上層水相，取下層有機相 8ml 至干凈玻 璃試管中，56℃水浴氮氣/空氣吹干； （4）加 1ml 正已烷振蕩 30 秒，再加入 1ml 復溶工 作液充分振蕩混合 30 秒；室溫 4000 轉/分，離心 5 分鐘； （5）去除上層有機相，取下層 50µl 液體用于分析。 6． 酶聯(lián)免疫分析程序 測定前須知： 1、使用之前將所有試劑和需用微孔板回升至室溫。 2、使用之后立即將所有試劑放回 2-8℃。 3、在使用中不要讓微孔干燥。 4、在 ELISA 分析中的重復性，很大程度上取決于 洗板的*性，正確的洗板操作是 ELISA 測定程序 中的要點。 5、在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用該 板膜蓋住微孔板。 測定步驟： 1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，在室溫下平衡 30 分鐘，每種液體使用前均須搖勻。注意標準液均 需做 2 個平行試驗。 2、加標準品/樣本 50µl /孔，然后加酶標記物 40μl/ 孔，再加入抗體工作液 40µl/孔。輕輕振蕩混勻，用 蓋板膜蓋板，25℃下避光反應 1 小時。 3、洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，加 洗滌液 250ml/孔，每次浸泡 15~30 秒，充分洗滌 4 －5 次，用吸水紙拍干。 4、顯色：每孔先各加入底物液 A 50μl，再各加入 底物液 B 50μl，輕輕晃蕩混勻，并在 25℃下避光反 應 15 分鐘。 5、讀數(shù)：每孔各加 50μl 終止液，在酶標儀于 450nm 處測定 OD 值（建議用 450/630nm 雙波長檢測，在 5 分鐘內讀完數(shù)據）。 7. 結果判定 1) 所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值 的平均值（B）除以*個標準（0 標準）的吸 光度值（B0）再乘以 100%，即百分吸光度值。 百分吸光度值（%）＝ B ×100% B0 以恩諾沙星準品濃度值（ppb）為 X 軸，百分 吸光度值為 Y 軸，繪制標準曲線圖。相對應每一個 樣品的濃度可以從標準曲線上讀出。也可以用回歸 方程法，計算出樣本溶液濃度。利用計算機專業(yè)軟 件，更便于大量樣品的快速分析。 2） 樣品的實際濃度為讀數(shù)結果乘以相應稀釋倍 數(shù)。 8. 注意事項 1） 室溫低于20℃或試劑及標本未回到室溫（20- 25℃）會導致數(shù)值偏低。 2) 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥過久的情況， 則會出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn) 象。所以洗板排干后應立即進行下一步操作。 3) 標準物質和顯色液對光敏感，避免直接暴露在 光線下。 4) 混合要均勻，洗板要*（包括加樣品和標準 液的時候都必需充分混合均勻）。 5) 反應停止液為強酸性物質，避免接觸皮膚。 6) 不要使用過了有效期的試劑盒，也不要稀釋或 攙雜使用不同生產廠家的試劑盒這樣會引起 靈敏度降低。 7) 試劑盒的儲存條件是2-8℃，切勿冷凍。 9. 檢測方法靈敏度、準確度、精密度 試劑盒靈敏度：0.5ppb 樣本低檢測限： 組織樣本…………………… 1ppb 蜂蜜樣本……………………1ppb 回收率： 組織樣本………………………………85±10% 蜂蜜樣本 …………………………… 85±10% 精密度： 試劑盒的變異系數(shù)均小于 10%