iElisa 黃曲霉毒素 B1 檢測(cè)試劑盒

iElisa 黃曲霉毒素 B1 檢測(cè)試劑盒

1. 概要 黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉的有毒的代 謝產(chǎn)物，主要存在于谷物、堅(jiān)果和飼料中。1993 年 黃曲霉毒素 B1 被世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研 究機(jī)構(gòu)劃定為Ⅰ類(lèi)致癌物，是一類(lèi)毒性*的劇毒 物質(zhì)。它被證明對(duì)人和動(dòng)物的肝臟、腎臟等組織和 器官具有很大的危害。中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：黃曲霉毒素 B1 在玉米、大米、小麥中*分別不得超過(guò) 20、 10、5μg/kg，各種飼料中黃曲霉毒素 B1 的*標(biāo) 準(zhǔn)為 10-50μg/kg。 2. 原理 測(cè)定的基礎(chǔ)是抗原-抗體反應(yīng)。微孔板上包被有 抗抗體。加入黃曲霉毒素 B1（AF-B1）標(biāo)準(zhǔn)品或樣 品、酶標(biāo)抗原和抗體后，游離的黃曲霉毒素 B1 與 酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體，抗體或抗體結(jié)合物與固定 在微孔板上的抗抗體再結(jié)合，沒(méi)有結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)品、 酶標(biāo)抗原及抗體被洗去，加入 TMB 底物顯藍(lán)色， 加入終止液后顏色由藍(lán)變黃，用酶標(biāo)儀在 450nm 處 檢測(cè)，吸光值與樣品中黃曲霉毒素 B1 含量成負(fù)相 關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出黃曲霉毒素 B1 的含 量。 3. 試劑盒的組成 1) 包被有抗抗體的96微孔板：1塊（96 孔，12條 ×8 孔） 2) 黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品：0 ng/ml、0.1 ng/ml、 0.3ng/ml、0.5ng/ml、1.0ng/ml、2.0ng/ml 4.0ng/ml 1 瓶 × 1.0ml 3) AF-B1酶標(biāo)抗原 1 瓶 ×10ml 4) AF-B1抗體 1 瓶 ×10ml 5) 10× 濃縮洗滌液： 1 瓶 × 50ml 6) AF-B1稀釋緩沖液A： 1 瓶 ×50ml 7) AF-B1稀釋緩沖液B： 1 瓶 ×50ml 8) 顯色底物TMB： 1 瓶 ×17ml 9) 終止液： 1 瓶 × 7ml 10) 試劑盒說(shuō)明書(shū)： 1 份 11) 質(zhì)檢報(bào)告： 1 份 4. 需要的儀器、試劑 1）儀器 —酶標(biāo)儀 450nm（iElisa 全自動(dòng)酶標(biāo)儀或相當(dāng)者） —微量移液器：20μl-200μl 單道，100μl-1000μl 單道, 50μl-300μl 八道 —多功能旋轉(zhuǎn)混合器（或者搖床、高速均質(zhì)器） —酶標(biāo)板振蕩器 —渦旋混合器 —氮?dú)獯蹈蓛x —50ml 離心管 —1.5ml 離心管 —離心機(jī) —定性濾紙 —過(guò)濾漏斗 —天平：感量 0.01g 2） 試劑 —樣品提取液 70%甲醇：取 700ml 甲醇，加 300ml 純水，混勻。 —純水（蒸餾水、去離子水）、正己烷、三氯甲烷、 甲醇 5. 樣品處理 5.1 谷物（玉米、小麥、大麥、大米、大豆）： 1） 稱取 5.0g 粉碎樣品于 50ml 離心管中，加入 25.0ml 樣品提取液 70%甲醇,置于多功能旋轉(zhuǎn) 混合器上振蕩 10 分鐘（或使用高速均質(zhì)器均質(zhì) 3 分鐘，或搖床上振蕩 40 分鐘）。 2） 將提取液用普通濾紙過(guò)濾，吸取 200μl 濾液置 于 1.5ml 離心管中，加入 300μl AF-B1 稀釋緩 沖液 A，用渦旋混合器混勻。 稀釋倍數(shù)：12.5 5.2 飼料： 1) 稱取 5.0g 粉碎樣品于 50ml 離心管中，加入 25.0ml 樣品提取液 70%甲醇,置于多功能旋轉(zhuǎn) 混合器上振蕩 10 分鐘（或使用高速均質(zhì)器均 質(zhì) 3 分鐘，或搖床上振蕩 40 分鐘）。 2) 將提取液用普通濾紙過(guò)濾，用 0.22μm 有機(jī)系 濾膜過(guò)濾后，取 100μl 濾液置于 1.5ml 離心管 中，加入 500ul AF-B1 稀釋緩沖液 B，用渦旋 混合器混勻。 稀釋倍數(shù)：305.3 植物油 1）稱取 2.5g 油樣品，加入 10mL 樣品提取液（70% 甲醇水），劇烈振蕩 3min（用手或振蕩器），或 搖床震蕩 10min。 2） 將提取液用普通濾紙過(guò)濾。吸取 200μl 濾液置 于 1.5ml 離心管中，加入 300μl AF-B1 稀釋緩 沖液 A，用渦旋混合器混勻。 稀釋倍數(shù)：10 倍 5.4 醬油、醋： 1） 取 5.0ml 樣品于 50ml 離心管中，加入 25.0ml 三氯甲烷置于多功能旋轉(zhuǎn)混合器上振蕩 10 分 鐘（或使用高速均質(zhì)器均質(zhì) 3 分鐘，或搖床上 振蕩 40 分鐘）。 2） 4000 轉(zhuǎn)離心 5 分鐘，取下層三氯甲烷溶液 5ml 與氮?dú)獯蹈蓛x（60℃）吹干。加入 4ml 70%甲 醇水渦旋混勻 1 分鐘，使其充分復(fù)溶。 3） 吸取 200μl 復(fù)溶液置于 1.5ml 離心管中，加入 300μl AF-B1 稀釋緩沖液 A，用渦旋混合器混 勻。 稀釋倍數(shù)：10 5.5 糕點(diǎn)： 1） 取 5.0g 樣品于 50ml 離心管中，加入 25.0ml 70% 甲醇水置于多功能旋轉(zhuǎn)混合器上振蕩 10 分鐘 （或使用高速均質(zhì)器均質(zhì) 3 分鐘，或搖床上振 蕩 40 分鐘）。 2） 定性濾紙過(guò)濾，取濾液 5ml 加入 10ml 三氯甲烷 渦旋 1min,4000 轉(zhuǎn)離心 5 分鐘，取下層澄清三 氯甲烷溶液 5ml 與氮?dú)獯蹈蓛x（60℃）吹干。 加入 2ml 70%甲醇水渦旋混勻 1 分鐘，使其充 分復(fù)溶。 3） 吸取 200μl 復(fù)溶液置于 1.5ml 離心管中，加入 300μl AF-B1 稀釋緩沖液 A，用渦旋混合器混 勻。 稀釋倍數(shù)：10 5.6 酒類(lèi)（白酒、啤酒、威士忌、櫻桃酒、葡萄酒 等） 1) 取 5.0ml 樣品于 50ml 離心管中，加入 25.0ml 三氯甲烷置于多功能旋轉(zhuǎn)混合器上振蕩 10 分 鐘（或使用高速均質(zhì)器均質(zhì) 3 分鐘，或搖床上 振蕩 40 分鐘）。 2) 3000 轉(zhuǎn)離心 5 分鐘，取上層澄清溶液 5ml 于氮 氣吹干儀（60℃）吹干。加入 5ml 70%甲醇水 渦旋混勻 1 分鐘，使其充分復(fù)溶。 3) 吸取 200μl 復(fù)溶液置于 1.5ml 離心管中，加入 300μl AF-B1 稀釋緩沖液 A，用渦旋混合器混 勻。 稀釋倍數(shù)：12.5 5.7 發(fā)酵液： 1) 吸取 40μl 液體樣品置于 1.5ml 離心管中 2) 加入 960μl AF-B1 稀釋緩沖液 B，用渦旋混合 器混勻。 稀釋倍數(shù)：25 5.8 尿液樣品： 1) 取 5ml 待檢樣品于 15ml 離心管中，3000r/min， 離心 10 分鐘 2) 吸取 100μl 離心后澄清樣品置于 1.5ml 離心管 中 3) 加入 400μl AF-B1 稀釋緩沖液 A，用渦旋混合 器混勻。 稀釋倍數(shù)：5 5.1 豆瓣醬等： 1) 稱取 5.0g 粉碎樣品于 50ml 離心管中，加入 25.0ml 樣品提取液 70%甲醇,置于多功能旋轉(zhuǎn) 混合器上振蕩 10 分鐘（或使用高速均質(zhì)器均質(zhì) 3 分鐘，或搖床上振蕩 40 分鐘）。 2) 將提取液用普通濾紙過(guò)濾，吸取 200μl 濾液置 于 1.5ml 離心管中，加入 300μl AF-B1 稀釋緩 沖液 A，用渦旋混合器混勻。 稀釋倍數(shù)：12.5 6． 酶聯(lián)免疫分析程序 6.1 測(cè)定之前注意事項(xiàng) 1) 使用前將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）。 2) 使用后迅速將試劑放入 2-8℃冷藏。 3) 在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于 洗板的*性，正確的洗板操作是 ELISA 測(cè)定 程序中的要點(diǎn)。 4) 所有溫育過(guò)程應(yīng)避免陽(yáng)光直射，并按要求用蓋 板覆蓋住酶標(biāo)板。 6.2 溶液的配制 1) 提取液的配制: 根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需的量配制 70%的 甲醇水溶液（水要用純水、或蒸餾水、去離子 水） 2) 洗滌液的配制：將濃縮洗滌液用純水稀釋 10 倍后使用。（例如：取 10 ml 濃縮液+90 ml 純 水, 可以用于 32 孔的檢測(cè)）。 6.3 測(cè)定程序 1) 將足夠標(biāo)準(zhǔn)品和樣品所用數(shù)量的孔條插入酶標(biāo)板架，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，記錄 下標(biāo)準(zhǔn)和樣品的位置。未使用的酶標(biāo)板用鋁箔 袋封好置 2-8℃冷藏保存。 2) 吸取 50μl 標(biāo)準(zhǔn)品或樣品分別加至相應(yīng)的微孔 （雙孔）中，然后各加入 50μl AF-B1 酶標(biāo)抗原， 再加入 50μl AF-B1 抗體，加蓋，在室溫溫育 20 分鐘（每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品必須使用新的吸 頭）。 3) 倒出孔中的液體，每孔加入 250μl 稀釋好的洗 滌液，置于酶標(biāo)板振蕩器上振蕩 30 秒鐘（或 者手工振蕩），重復(fù)操作四次。洗完后用力在 吸水紙上拍干。 4) 每孔加入150μl顯色底物TMB，室溫避光溫育 10分鐘。 5) 每孔加入50μl 終止液。 6) 置于酶標(biāo)儀中，振蕩混勻，在450nm處測(cè)定吸 光度值（OD值），參比波長(zhǎng)630nm。（iElisa全 自動(dòng)酶標(biāo)儀可以直接讀出、打印濃度值）。 7. 結(jié)果判定 1）所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的 平均值（B）除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0 標(biāo)準(zhǔn)）的吸光 度值（B0）再乘以 100%，即百分吸光度值。 百分吸光度值（%）＝ B ×100% B0 以黃曲霉毒素 B1 標(biāo)準(zhǔn)品濃度值（ppb）為 X 軸， 百分吸光度值為 Y 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。相對(duì)應(yīng)每 一個(gè)樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。也可以用 回歸方程法，計(jì)算出樣本溶液濃度。利用計(jì)算機(jī)專(zhuān) 業(yè)軟件，更便于大量樣品的快速分析。 2） 樣品的實(shí)際濃度為讀數(shù)結(jié)果乘以相應(yīng)稀釋倍 數(shù)。 3） 如果測(cè)定值超出檢測(cè)范圍，樣品提取溶液按一 定的比例用 70%甲醇進(jìn)行稀釋。 8. 注意事項(xiàng) 1) 室溫低于20℃或試劑及樣品未回到室溫（20- 25℃）會(huì)導(dǎo)致數(shù)值偏低。 2) 在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥過(guò)久的情況， 則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn) 象。所以洗板排干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。 3) 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和顯色液對(duì)光敏感，避免直接暴露在 光線下。 4) 混合要均勻，洗板要*（包括加樣品和標(biāo)準(zhǔn) 液的時(shí)候都必需充分混合均勻）。 5) 終止液為強(qiáng)酸性物質(zhì)，避免接觸皮膚。 6) 不要使用過(guò)了有效期的試劑盒，也不要混合使 用不同批次的試劑盒，這樣會(huì)引起測(cè)定結(jié)果不 準(zhǔn)確。 7) 試劑盒的儲(chǔ)存條件是2-8℃，切勿冷凍。 9. 試劑盒的性能指標(biāo) 1) 檢測(cè)限 LOD: 谷 物 0.6ppb(μg/kg) ， 飼 料 1.8ppb(μg/kg)，植物油 0.6ppb(μg/kg)，醬油、 醋 0.6ppb(μg/kg)，糕點(diǎn) 0.6ppb(μg/kg)，酒類(lèi) 0.6ppb(μg/kg),發(fā)酵液 1.5ppb(μg/kg)，尿液類(lèi) 0.3ppb(μg/kg)，豆瓣醬 1.0ppb。（LOD：空白樣 品測(cè)定值+2 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差 SD） 2) 定量限 LOQ: 谷 物 1.25ppb(μg/kg) ， 飼 料 3.0ppb(μg/kg)，植物油 1.0ppb(μg/kg)，醬油、 醋 1.0ppb(μg/kg)，糕點(diǎn) 1.0ppb(μg/kg)，酒類(lèi) 1.25ppb(μg/kg),發(fā)酵液 2.5ppb(μg/kg)，尿液類(lèi) 0.5ppb(μg/kg)，豆瓣醬 2.0ppb。 3) 定 量 檢 測(cè) 范 圍 ： 谷 物 1.25-50ppb ， 飼 料 3.0-120ppb ，植物油 1.0-40ppb ， 醬 油 、 醋 1.0-40ppb，糕點(diǎn) 1.0-40ppb，酒類(lèi) 1.25-50ppb, 發(fā)酵液 2.5-100ppb, 尿液類(lèi) 0.5ppb-20ppb，豆瓣 醬 2.0-50ppb。