iElisa 黃曲霉毒素 M1檢測試劑盒

iElisa 黃曲霉毒素 M1檢測試劑盒

1. 概要 黃曲霉毒素是一類真菌（如黃曲霉和寄生曲 霉）的有毒的代謝產(chǎn)物，它們具有很強(qiáng)的致癌性. 黃 曲霉毒素 M1 是黃曲霉毒素 B1的代謝產(chǎn)物。經(jīng)攝入 含有黃曲霉毒素 B1飼料的奶牛產(chǎn)出的牛奶中，其中 便含有黃曲霉毒素 M1。由于黃曲霉毒素 M1 相當(dāng)穩(wěn) 定，巴氏滅菌法也無法將其殺滅，所以檢測黃曲霉 毒素 M1 不僅要在飼料原料中檢測，而且在終產(chǎn) 品中的含量也需要進(jìn)行測定。 黃曲霉毒素 M1 的檢測方法有高效液相色譜法 (HPLC)，薄層層析法(TLC)和酶聯(lián)免疫吸附法 (ELISA)等。 用 iElisa 黃曲霉毒素 M1快速檢測試劑盒可以準(zhǔn) 確地檢測牛奶、酸奶、奶酪和奶粉中的黃曲霉毒素 M1。 2. 原理 本產(chǎn)品是利用抗體-抗原免疫反應(yīng)檢測原理建 立的一種定量檢測試劑盒。加入黃曲霉毒素M1 （AFLA M1）標(biāo)準(zhǔn)品或樣品后，黃曲霉毒素M1與微 孔中的抗體相結(jié)合。洗去沒有結(jié)合的黃曲霉毒素 M1，加入酶標(biāo)抗原，與黃曲霉毒素M1與抗體沒有 結(jié)合的部位相結(jié)合。洗去沒有結(jié)合的酶標(biāo)抗原，加 入TMB底物顯藍(lán)色，加入終止液后顏色由藍(lán)變黃， 用酶標(biāo)儀在450nm處檢測，吸光值與樣品中黃曲霉 毒素M1含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出黃 曲霉毒素M1的含量。 3. 試劑盒的組成 1) 包被有抗體的96微孔板：1塊（96 孔，12 條×8 孔） 2) 黃曲霉M1標(biāo)準(zhǔn)品：0 ng/mL 、0.05 ng/mL、 0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/Ml： 1 瓶 × 1.0mL 3) AF-M1酶標(biāo)抗原： 1 瓶 × 15mL 4) 10× 濃縮洗滌液： 1 瓶 × 50mL 5) AF-M1稀釋緩沖液 1 瓶 × 50mL 6) 顯色底物液： 1 瓶 ×12mL 7) 反應(yīng)終止液： 1 瓶 × 13mL 8) 試劑盒說明書 9) 質(zhì)控報(bào)告 4. 需要的儀器、試劑 1）儀器 —酶標(biāo)儀 450nm（iElisa 全自動(dòng)酶標(biāo)儀或相當(dāng)者） —微量移液器：20μL-200μL 單道，100μL-1000μL 單道, 50μL-300μL 八道 —高速離心機(jī) —酶標(biāo)板振蕩器 —渦旋混合器 —振蕩器 —蒸發(fā)設(shè)備、恒溫箱 —100mL 量筒 —計(jì)時(shí)器 —天平：感量 0.01g —離心管 1.5mL、50mL 2）試劑 —甲醇、正庚烷、二氯甲烷 5. 樣品處理 5.1 牛奶： 1) 取牛奶1.0 mL樣品，用離心機(jī)（4000RPM）離 心10min.。 2) 離心后用移液器*去除上層奶油。 3) 取200μL下層脫脂牛奶，加入200μLAF-M1稀釋 緩沖液（1:1）稀釋。 稀釋倍數(shù)：2 5.2 酸奶： 1) 取酸奶樣品2.0g，用離心機(jī)（4000RPM）離心 10min 。（如沒有冷凍離心機(jī)，可將樣品先冷 卻到10℃，再離心） 2) 離心后，取200μL上層澄清液于1.5mL離心管 中，加入200μL AF-M1稀釋緩沖液（1:1）稀釋， 渦旋混合器混勻。 稀釋倍數(shù)：2 5.3 奶粉： 1) 用天平稱取2.0g奶粉到錐形瓶中，再加入10ml 50℃左右的純水（還原牛奶）。 2) 用力振蕩3min.，使充分溶解。 3) 按照5.1牛奶樣品處理步驟進(jìn)行。 稀釋倍數(shù)：10 （檢測范圍：0.5---5 ppb） 5.4 奶粉（高靈敏度）：1) 用天平稱取2.0g奶粉到錐形瓶中，再加入5ml 50℃左右的純水（還原牛奶）。 2) 用力振蕩3min.，使充分溶解。 3) 按照5.1牛奶樣品處理步驟進(jìn)行。 稀釋倍數(shù)為5（檢測范圍：0.25---2.5 ppb） 5.5 奶酪： 1) 用天平稱取2.0g粉碎的奶酪放入離心瓶中，加 入40.0mL二氯甲烷，充分溶解混勻后，劇烈振 蕩15min.。 2) 過濾，取10.0mL，60℃氮?dú)獯蹈伞?3) 分別加入0.5mL甲醇、0.5mL PBS、1.0mL庚烷， 復(fù)容。 4) 3000轉(zhuǎn)/分鐘離心15min.。 5) *去除上層庚烷。 6) 取100μL下層提取液于1.5mL離心管中，加入 400μL AF-M1稀釋緩沖液（1:4）稀釋，渦旋混 合器混勻，取100μL用于檢測。 稀釋倍數(shù)：10 6． 酶聯(lián)免疫分析程序 6.1 測定之前注意事項(xiàng) 1) 使用前將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）。 2) 使用后迅速將試劑放入 2-8℃冷藏。 3) 在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于 洗板的*性，正確的洗板操作是 ELISA 測定 程序中的要點(diǎn)。 4) 所有溫育過程應(yīng)避免陽光直射，并按要求用蓋 板覆蓋住酶標(biāo)板。 6.2 溶液的配制 洗滌液的配制：將濃縮洗滌液用純水稀釋 10 倍后 使用。（例如：取 10 mL 濃縮液+90 mL 純水, 可以 用于 32 孔的檢測）。 6.3 測定程序 1) 將足夠標(biāo)準(zhǔn)品和樣品所用數(shù)量的孔條插入酶 標(biāo)板架，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，記錄 下標(biāo)準(zhǔn)和樣品的位置。未使用的酶標(biāo)板用鋁箔 袋封好置 2-8℃冷藏保存。 2) 分別吸取100μL 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加至相應(yīng)的微 孔（雙孔）中,，加蓋，室溫溫育50min.。 3) 倒出孔中的液體，每孔加入 250μL 稀釋好的洗 滌液，置于酶標(biāo)板振蕩器上振蕩 30 秒鐘（或 者手工振蕩），重復(fù)操作四次。洗完后用力在 吸水紙上拍干。 4) 每孔加入AF-M1酶標(biāo)抗原100μL，加蓋，室溫 溫育30min.。 5) 倒出孔中的液體，每孔加入 250μL 稀釋好的洗 滌液，置于酶標(biāo)板振蕩器上振蕩 30 秒鐘（或 者手工振蕩），重復(fù)操作四次。洗完后用力在 吸水紙上拍干。 6) 每孔加入100μL顯色底物液，加蓋，室溫溫育 10min.。 7) 每孔加入50μL 反應(yīng)終止液。 8) 置于酶標(biāo)儀中，振蕩混勻，在450nm處測定吸 光度值（OD值），參考波長630nm。（iElisa全 自動(dòng)酶標(biāo)儀可以直接讀出、打印濃度值） 7. 結(jié)果判定 1) 所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值 的平均值（B）除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0 標(biāo)準(zhǔn)）的吸 光度值（B0）再乘以 100%，即百分吸光度值。 百分吸光度值（%）＝ B ×100% B0 以黃曲霉標(biāo)準(zhǔn)品濃度值（ppb）為 X 軸，百分 吸光度值為 Y 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。相對應(yīng)每一個(gè) 樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。也可以用回歸 方程法，計(jì)算出樣本溶液濃度。利用計(jì)算機(jī)專業(yè)軟 件，更便于大量樣品的快速分析。 2） 樣品的實(shí)際濃度為讀數(shù)結(jié)果乘以相應(yīng)稀釋倍 數(shù)。 3） 如果測定值超出檢測范圍，樣品提取溶液按一 定的比例用陰性牛奶樣品進(jìn)行稀釋。 8. 注意事項(xiàng) 1) 室溫低于20℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20- 25℃）會(huì)導(dǎo)致數(shù)值偏低。 2) 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥過久的情況， 則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn) 象。所以洗板排干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。 3) 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和顯色液對光敏感，避免直接暴露在 光線下。 4) 混合要均勻，洗板要*（包括加樣品和標(biāo)準(zhǔn) 液的時(shí)候都必需充分混合均勻）。 5) 反應(yīng)停止液為強(qiáng)酸性物質(zhì)，避免接觸皮膚。 6) 不要使用過了有效期的試劑盒，也不要混合使 用不同批次的試劑盒，這樣會(huì)引起測定結(jié)果不 準(zhǔn)確。 7) 試劑盒的儲(chǔ)存條件是2-8℃，切勿冷凍。 9. 檢測方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度 1）試劑盒靈敏度: 0.05ppb 2）檢測范圍：牛奶 0.1---1.0 ppb酸奶 0.1---1.0 ppb 奶粉 0.5---5.0ppb；0.25---2.5 ppb 奶酪 0.5---5.0ppb 3）試劑盒變異系數(shù)：小于 20%。 4）試劑盒準(zhǔn)確度：回收率范圍在70%-110%之間。