iElisa 卡那霉素檢測(cè)試劑盒

iElisa 卡那霉素檢測(cè)試劑盒

1. 概要 卡那霉素是氨基糖甙類(lèi)抗生素, 被廣范應(yīng)用于 動(dòng)物疾病的治療，由于其具有神經(jīng)毒性和腎臟毒 性，損害第 8 對(duì)腦神經(jīng)，導(dǎo)致前庭和耳蝸損傷，腎 毒性主要表現(xiàn)為近端身曲管損傷，出現(xiàn)蛋白質(zhì)尿、 血尿、腎功能減退等。目前，ELISA 檢測(cè)方法作為 卡那霉素殘留檢測(cè)的篩選方法已被廣泛使用。 本試劑盒是應(yīng)用 ELISA 研發(fā)的新一代藥物殘留 檢測(cè)產(chǎn)品，與儀器分析技術(shù)相比具有快速、簡(jiǎn)便、 準(zhǔn)確和靈敏度高等特點(diǎn),操作時(shí)間僅需 30 分鐘，能 大限度地減少操作誤差和工作強(qiáng)度。 2. 原理 本試劑盒采用直接競(jìng)爭(zhēng) ELISA 方法，在酶標(biāo)板 微孔條上預(yù)包被卡那霉素抗體，樣本中殘留的卡那 霉素將和酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)包被在酶標(biāo)板上的抗卡那 霉素抗體，用 TMB 底物顯色，樣本吸光值與殘留 物卡那霉素的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘 以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出待檢中卡那霉素的 含量。 3. 試劑盒組成 1) 包被有抗體的96微孔板：1塊（96 孔，12 條×8 孔） 2) 卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品： 0 、0.2、0.5、1.0、3.0ng/ml 1 瓶× 1.0ml 3) KAN酶標(biāo)抗原： 1 瓶 × 15ml 4) 10× 濃縮洗滌液： 1 瓶 × 50ml 5) 稀釋緩沖液： 1 瓶 × 50ml 6) 顯色底物： 1 瓶 ×13ml 7) 終止液： 1 瓶 × 7ml 8) 試劑盒說(shuō)明書(shū) 9) 稀釋孔板： 1塊（96 孔） 10) 質(zhì)檢報(bào)告 4. 需要的儀器、試劑 1）儀器 —酶標(biāo)儀 450nm（iElisa 全自動(dòng)酶標(biāo)儀或相當(dāng)者） —微量移液器 20μl～200μl，100μl～1000μl —25ml 錐形瓶或 50ml 離心管 —8 道微量移液器 —酶標(biāo)板振蕩器 —天平：感量 0.01g 2） 試劑 —蒸餾水 —pH7.4 PBS 溶液 —0.1mol/mL HCl、0.1 mol/mL NaOH 5 溶液的配制 洗滌液的配制：將濃縮洗滌液用去離子水稀釋 10 倍后使用（1 份濃縮洗滌液加 9 份蒸餾水）。 6. 樣品處理 6.1 牛奶樣品 1) 取 10 mL 牛奶樣品于 50 mL 離心管中，4000 r/min 離心去蛋白。 2) 去除上層脂肪，吸取 20μl 中間層置于 1.5ml 離 心管中，加入 980μlKAN 稀釋緩沖液，用渦旋 混合器混勻。 3) 取樣品稀釋液 50μL 于 ELISA 進(jìn)行檢測(cè)。 稀釋倍數(shù)：50 6.2 動(dòng)物源性食品（豬肉，豬肝，牛肉等） 1) 稱(chēng)取勻漿后的樣品 5g，加入 20mL 樣品提取液 （pH7.4 PBS 溶液），搖床振蕩 30min。 2) 靜置 1min，3000/min 離心 10min。吸取 50μl 取上清液于 1.5ml 離心管中，加入 450μl KAN 稀釋緩沖液, 用渦旋混合器混勻。 3) 取樣品稀釋液 50μL 于 ELISA 進(jìn)行檢測(cè) 稀釋倍數(shù)：40 6.3 凍干藥品 取 10mg 樣品，用 1ml 樣品復(fù)溶液復(fù)溶樣品，用 0.1 mol/mL HCl 或 0.1 mol/mL NaOH 調(diào)整溶液 pH 值在 6.0-8.0 之間，取 50μl 檢測(cè)。 稀釋倍數(shù)：1 6.4 血液樣品 取血漿過(guò)夜（4℃）, 4000r/min 離心 10 分鐘， 取上清液，用稀釋緩沖液按 1：19 的比例離心后上清液 （吸取 50μl 過(guò)濾液，加入 950μl 稀釋液緩沖 液）。 稀釋倍數(shù)：20 7． 酶聯(lián)免疫分析程序 7.1 測(cè)定之前注意事項(xiàng) 1) 使用前將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）。 2) 使用后迅速將試劑放入 2-8℃冷藏。 3) 在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于 洗板的*性，正確的洗板操作是 ELISA 測(cè)定 程序中的要點(diǎn)。 4) 所有孵育過(guò)程應(yīng)避免陽(yáng)光直射，并按要求用蓋 板覆蓋住酶標(biāo)板。 7.2 測(cè)定程序 1) 將足夠標(biāo)準(zhǔn)品和樣品所用數(shù)量的稀釋孔板放 于板架上。 2) 將同等數(shù)量的包被有抗體的微孔板插入另一 板架，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，記錄下 標(biāo)準(zhǔn)和樣品的位置。未使用的酶標(biāo)板用鋁箔袋 封好置 2-8℃冷藏保存。 3) 分別吸取 75μl 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加至相應(yīng)的空的 微孔（雙孔）中，然后各加入 75μl 的 KAN 酶 標(biāo)抗原（可用排槍?zhuān)瑢⒁埔浩髡{(diào)至 100μl，每 孔混勻 5 次后，吸取 100μl 混合的溶液，加入 到包被有抗體的酶標(biāo)板架中（可用排槍?zhuān)?37℃溫育 30min（每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)和樣品必須使用新 的吸頭）。 4) 倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍 打以保證*除去孔中的液體，然后每孔加入 250μl 稀釋好的洗滌液洗滌，振蕩后倒出孔中 的液體，拍干；重復(fù)操作四次，洗板時(shí)每次間 隔20s，洗完后用力在吸水紙上排干。 5) 每孔加入100μl顯色底物，37℃避光溫育10min。 6) 每孔加入50μl 終止液，混勻。 7) 置于酶標(biāo)儀中，振蕩混勻，在450nm處測(cè)定吸 光度值（OD值），參比波長(zhǎng)630nm。（iElisa全 自動(dòng)酶標(biāo)儀可以直接讀出、打印濃度值）。 8. 結(jié)果判定 1) 所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值 的平均值（B）除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0 標(biāo)準(zhǔn)）的吸 光度值（B0）再乘以 100%，即百分吸光度值。 百分吸光度值（%）＝ B ×100% B0 以卡那霉素準(zhǔn)品濃度值（ppb）為 X 軸，百分 吸光度值為 Y 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。相對(duì)應(yīng)每一個(gè) 樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。也可以用回歸 方程法，計(jì)算出樣本溶液濃度。利用計(jì)算機(jī)專(zhuān)業(yè)軟 件，更便于大量樣品的快速分析。 2） 樣品的實(shí)際濃度為讀數(shù)結(jié)果乘以相應(yīng)稀釋倍 數(shù)。 3） 如果測(cè)定值超出檢測(cè)范圍，樣品提取溶液按一 定的比例用 pH7.4 PBS 進(jìn)行稀釋。 9. 注意事項(xiàng) 1) 室溫低于20℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20- 25℃）會(huì)導(dǎo)致數(shù)值偏低。 2) 在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥過(guò)久的情況， 則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn) 象。所以洗板排干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。 3) 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和顯色液對(duì)光敏感，避免直接暴露在 光線下。 4) 混合要均勻，洗板要*（包括加樣品和標(biāo)準(zhǔn) 液的時(shí)候都必需充分混合均勻）。 5) 反應(yīng)停止液為強(qiáng)酸性物質(zhì)，避免接觸皮膚。 6) 不要使用過(guò)了有效期的試劑盒，也不要稀釋或 攙雜使用不同生產(chǎn)廠家的試劑盒這樣會(huì)引起 靈敏度降低。 6） 試劑盒的儲(chǔ)存條件是2-8℃，切勿冷凍。 10. 檢測(cè)方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度 1) 試劑盒靈敏度: 0.2ppb 2) 試劑盒變異系數(shù)：小于 20%。 3) 試劑盒準(zhǔn)確度：回收率范圍在 70％-120％之 間。