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iElisaT-2 毒素檢測試劑盒

1. 概要 T2 毒素（T2）是由多種鐮刀菌產(chǎn)生的一種霉菌 毒素。主要污染小麥、大麥、玉米等糧食作物及其 制品，對人類健康及畜牧業(yè)構(gòu)成了較大危害。T-2 毒素主要影響血液，肝臟，腎臟，胰腺肌肉及淋巴 細(xì)胞的功能，T-2 毒素中毒后的一般臨床癥狀為厭 食、嘔吐、腹瀉、生長停滯、繁殖和神經(jīng)機能障礙 等。使用 T2 毒素試劑盒則能夠快速而準(zhǔn)確的分析 樣品中 T2 毒素殘留。 2. 原理 測定的基礎(chǔ)是抗原-抗體反應(yīng)。微孔板上包被有 偶聯(lián)抗原。分別加入T2毒素標(biāo)準(zhǔn)品或樣品、抗體和 酶標(biāo)二抗于微孔中，樣品/標(biāo)準(zhǔn)品競爭結(jié)合抗體，酶 標(biāo)二抗可與一抗結(jié)合而于酶標(biāo)版上的包被抗原結(jié) 合。反應(yīng)洗滌后，加入TMB底物顯藍(lán)色，加入終止 液后顏色由藍(lán)變黃，用酶標(biāo)儀在450nm處檢測，吸 光值與樣品中T2毒素含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比 較即可得出T2毒素的含量。 3. 試劑盒的組成 1) 包被有抗原的96微孔板：1塊（96 孔，12條×8 孔） 2) T2毒素標(biāo)準(zhǔn)品：0 ng/ml、0.5 ng/ml、 1.0ng/ml、2.0ng/ml、5.0ng/ml、20ng/ml 1 瓶 × 1.0ml 3) T2抗體 1 瓶 ×10ml 4) 酶標(biāo)抗體 1 瓶 ×10ml 5) 10× 濃縮洗滌液： 1 瓶 × 50ml 6) T2稀釋緩沖液A： 1 瓶 ×50ml 7) T2稀釋緩沖液B： 1 瓶 ×50ml 8) 顯色底物TMB： 1 瓶 ×17ml 9) 終止液： 1 瓶 × 7ml 10) 試劑盒說明書： 1 份 11) 質(zhì)檢報告： 1 份 4. 需要的儀器、試劑 1）儀器 —酶標(biāo)儀 450nm（iElisa 全自動酶標(biāo)儀或相當(dāng)者） —微量移液器：20μl-200μl 單道，100μl-1000μl 單道, 50μl-300μl 八道 —多功能旋轉(zhuǎn)混合器（或者搖床、高速均質(zhì)器） —酶標(biāo)板振蕩器 —渦旋混合器 —50ml 離心管 —1.5ml 離心管 —定性濾紙 —過濾漏斗 —天平：感量 0.01g 2） 試劑 —樣品提取液 70%甲醇：取 700ml 甲醇，加 300ml 純水，混勻。 5. 樣品處理 5.1 谷物（玉米、小麥、高粱、大米、大豆）： 1） 稱取 5.0g 粉碎樣品于 50ml 離心管中，加入 25.0ml 樣品提取液 70%甲醇,置于多功能旋轉(zhuǎn) 混合器上振蕩 30 分鐘（或使用高速均質(zhì)器均質(zhì) 3 分鐘，或搖床上振蕩 40 分鐘）。 2） 將提取液用普通濾紙過濾，吸取 100μl 濾液置 于 1.5ml 離心管中，加入 500μl T2 稀釋緩沖液 A，用渦旋混合器混勻。 稀釋倍數(shù)：30 5.2 飼料： 1) 稱取 5.0g 粉碎樣品于 50ml 離心管中，加入 25.0ml 樣品提取液 70%甲醇,置于多功能旋轉(zhuǎn) 混合器上振蕩 30 分鐘（或使用高速均質(zhì)器均 質(zhì) 3 分鐘，或搖床上振蕩 40 分鐘）。 2) 將提取液用普通濾紙過濾，用 0.22μm 有機系 濾膜過濾后，取 50μl 濾液置于 1.5ml 離心管中， 加入 500ul T2 稀釋緩沖液 B，用渦旋混合器混 勻。 稀釋倍數(shù)：30 6． 酶聯(lián)免疫分析程序 6.1 測定之前注意事項 1) 使用前將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）。 2) 使用后迅速將試劑放入 2-8℃冷藏。 3) 在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于 洗板的*性，正確的洗板操作是 ELISA 測定 程序中的要點。4) 所有溫育過程應(yīng)避免陽光直射，并按要求用蓋 板覆蓋住酶標(biāo)板。 6.2 溶液的配制 1) 提取液的配制: 根據(jù)實驗所需的量配制 70%的 甲醇水溶液（水要用純水、或蒸餾水、去離子 水） 2) 洗滌液的配制：將濃縮洗滌液用純水稀釋 10 倍后使用。（例如：取 10 ml 濃縮液+90 ml 純 水, 可以用于 32 孔的檢測）。 6.3 測定程序 1） 將足夠標(biāo)準(zhǔn)品和樣品所用數(shù)量的孔條插入酶 標(biāo)板架，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做兩個平行實驗，記錄 下標(biāo)準(zhǔn)和樣品的位置。未使用的酶標(biāo)板用鋁箔 袋封好置 2-8℃冷藏保存。 2） 分別吸取50μl 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加至相應(yīng)的微孔 （雙孔）中，然后再各加入50μl的酶標(biāo)二抗， 后加入50μl的T2抗體，裝入袋中密封，室溫 （25℃）溫育15min。 3） 倒出孔中的液體，每孔加入250μl 稀釋好的洗 滌液洗滌，重復(fù)操作四次。洗板時每次間隔30s， 洗完后用力在吸水紙上排干。 4） 每孔加入100μl顯色底物，避光室溫（25℃）溫 育10min。 5） 每孔加入50μl終止液，混勻。 6） 置于酶標(biāo)儀中，振蕩混勻，在450nm處測定吸 光度值（OD值），參比波長630nm。（iElisa全 自動酶標(biāo)儀可以直接讀出、打印濃度值）。 7. 結(jié)果判定 1）所獲得的每個濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的 平均值（B）除以*個標(biāo)準(zhǔn)（0 標(biāo)準(zhǔn)）的吸光 度值（B0）再乘以 *，即百分吸光度值。 百分吸光度值（%）＝ B ×* B0 以 T2 毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度值（ppb）為 X 軸，百分 吸光度值為 Y 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。相對應(yīng)每一個 樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。也可以用回歸 方程法，計算出樣本溶液濃度。利用計算機專業(yè)軟 件，更便于大量樣品的快速分析。 2） 樣品的實際濃度為讀數(shù)結(jié)果乘以相應(yīng)稀釋倍 數(shù)。 3） 如果測定值超出檢測范圍，樣品提取溶液按一 定的比例用 70%甲醇進(jìn)行稀釋。 8. 注意事項 1) 室溫低于20℃或試劑及樣品未回到室溫（20- 25℃）會導(dǎo)致數(shù)值偏低。 2) 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥過久的情況， 則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn) 象。所以洗板排干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。 3) 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和顯色液對光敏感，避免直接暴露在 光線下。 4) 混合要均勻，洗板要*（包括加樣品和標(biāo)準(zhǔn) 液的時候都必需充分混合均勻）。 5) 終止液為強酸性物質(zhì)，避免接觸皮膚。 6) 不要使用過了有效期的試劑盒，也不要混合使 用不同批次的試劑盒，這樣會引起測定結(jié)果不 準(zhǔn)確。 7) 試劑盒的儲存條件是2-8℃，切勿冷凍。 9. 試劑盒的性能指標(biāo) 1) 檢測限 LOD: 谷物 10ppb(μg/kg)，飼料 20ppb， （LOD：空白樣品測定值+2 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差 SD） 2) 定量限 LOQ: 谷物 15ppb，飼料 20ppb。 3) 定 量 檢 測 范 圍 ： 谷 物 15-600ppb ， 飼 料 20-600ppb。

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