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iElisa 嘔吐毒素檢測試劑盒

iElisa 嘔吐毒素檢測試劑盒

1. 概要 嘔吐毒素也稱為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）， 是由串珠鐮刀菌、輪狀鐮刀菌以及多育鐮刀菌等產(chǎn) 生的真菌毒素，大多存在于糧谷、飼料及其制品中。 中毒后影響消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)，主要表現(xiàn)為惡 心、嘔吐、頭痛、頭暈、腹痛、腹瀉等癥狀。我國 標準規(guī)定：玉米、大麥、小麥及其制品中嘔吐毒素 不得超過 1mg/kg，豬、犢牛、泌乳期動物配合飼料 中嘔吐毒素不得超過 1mg/kg，牛、家禽配合飼料中 嘔吐毒素不得超過 5mg/kg。 2. 原理 測定的基礎(chǔ)是抗原-抗體反應(yīng)。微孔板上包被有 抗抗體。加入嘔吐毒素（DON）標準品或樣品、酶 標抗原和抗體后，游離的嘔吐毒素與酶標抗原競爭 結(jié)合抗體，抗體或抗體結(jié)合物與固定在微孔板上的 抗抗體再結(jié)合，沒有結(jié)合的標準品、酶標抗原及抗 體被洗去，加入 TMB 底物顯藍色，加入終止液后 顏色由藍變黃，用酶標儀在 450nm 處檢測，吸光值 與樣品中嘔吐毒素含量成負相關(guān)，與標準曲線比較 即可得出嘔吐毒素的含量。 3. 試劑盒的組成 1) 包被有抗抗體的96微孔板：1塊（96 孔，12 條 ×8 孔） 1) 嘔吐毒素標準品：0 ng/ml 、10ng/ml、 20ng/ml、50ng/ml、200ng/ml 1 瓶 × 1.0ml 2) DON抗體： 1 瓶 × 10ml 3) DON酶標抗原： 1 瓶 × 10ml 4) 10× 濃縮洗滌液： 1 瓶 × 50ml 5) DON稀釋緩沖液A： 1 瓶 ×50ml 6) DON稀釋緩沖液B： 1 瓶 ×50ml 7) 顯色底物TMB： 1 瓶 ×17ml 8) 終止液： 1 瓶 × 7ml 9) 試劑盒說明書： 1 份 10) 質(zhì)檢報告： 1 份 4. 需要的儀器、試劑 1） 儀器 —酶標儀 450nm（iElisa 全自動酶標儀或相當者） —微量移液器：20μl-200μl 單道，100μl-1000μl 單道, 50μl-300μl 八道 —多功能旋轉(zhuǎn)混合器（或者搖床、高速均質(zhì)器） —酶標板振蕩器 —渦旋混合器 —離心機 —50ml 離心管 —1.5ml 離心管 —定性濾紙 —過濾漏斗 —天平：感量 0.01g 2） 試劑 —純水（蒸餾水、去離子水） 5. 樣品處理 5.1 谷物（玉米、小麥、大麥、大米、大豆）： 1） 稱取 5.0g 粉碎樣品于 50ml 離心管中，加入 25.0ml 樣品提取液純水,置于多功能旋轉(zhuǎn)混合 器上振蕩 10 分鐘（或使用高速均質(zhì)器均質(zhì) 3 分鐘，或搖床上振蕩 40 分鐘），3000 轉(zhuǎn)/分離 心 5min。 2） 將上層提取液用普通濾紙過濾，吸取 100μl 濾 液置于 1.5ml 離心管中，加入 400μl DON 稀釋 緩沖液 A，用渦旋混合器混勻。 稀釋倍數(shù)：25 5.2 飼料： 1) 稱取 5.0g 粉碎樣品于 50ml 離心管中，加入 25.0ml 樣品提取液純水,置于多功能旋轉(zhuǎn)混合 器上振蕩 10 分鐘（或使用高速均質(zhì)器均質(zhì) 3 分鐘，或搖床上振蕩 40 分鐘），3000 轉(zhuǎn)/分離 心 5min。 2) 將上層提取液用普通濾紙過濾，測 pH 值，如 果不在 pH6-8 范圍內(nèi)，請用酸或堿進行調(diào)整。 3) 吸取 50μl 濾液置于 1.5ml 離心管中，加入 450ul DON 稀釋緩沖液 B，用渦旋混合器混勻。 稀釋倍數(shù)：50 5.3 發(fā)酵液： 吸取 40μl 液體樣品置于 1.5ml 離心管中，加入 960μl DON 稀釋緩沖液 B，用渦旋混合器混勻。 稀釋倍數(shù)：255.4 尿液樣品： 1) 取 5ml 待檢樣品于 15ml 離心管中，3000r/min， 離心 10 分鐘 2) 吸取 100μl 離心后澄清樣品置于 1.5ml 離心管 中 3) 加入 400μl DON 稀釋緩沖液 A，用渦旋混合器 混勻。 稀釋倍數(shù)：5 6． 酶聯(lián)免疫分析程序 6.1 測定之前注意事項 1) 使用前將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）。 2) 使用后迅速將試劑放入 2-8℃冷藏。 3) 在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于 洗板的*性，正確的洗板操作是 ELISA 測定 程序中的要點。 4) 所有溫育過程應(yīng)避免陽光直射，并按要求用蓋 板覆蓋住酶標板。 6.2 溶液的配制 1) 提取液的配制:純水（或蒸餾水、去離子水）。 2) 洗滌液的配制：將濃縮洗滌液用純水稀釋 10 倍后使用。（例如：取 10 ml 濃縮液+90 ml 純 水, 可以用于 32 孔的檢測）。 6.3 測定程序 1) 將足夠標準品和樣品所用數(shù)量的孔條插入酶 標板架，標準品和樣品做兩個平行實驗，記錄 下標準和樣品的位置。未使用的酶標板用鋁箔 袋封好置 2-8℃冷藏保存。 2) 吸取 50μl 標準品或樣品分別加至相應(yīng)的微孔 （雙孔）中，然后各加入 50μl 的 DON 酶標抗 原、50μl 的 DON 抗體，加蓋，在 37℃溫育 30 分鐘（每個標準品和樣品必須使用新的吸頭）。 3) 倒出孔中的液體，每孔加入 250μl 稀釋好的洗 滌液，置于酶標板振蕩器上振蕩 30 秒鐘（或 者手工振蕩），重復(fù)操作四次。洗完后用力在 吸水紙上拍干。 4) 每孔加入150μl底物，37℃避光溫育10分鐘。 5) 每孔加入50μl 終止液。 6) 置于酶標儀中，振蕩混勻，在450nm處測定吸 光度值（OD值），參比波長630nm。（iElisa全 自動酶標儀可以直接讀出、打印濃度值）。 7. 結(jié)果判定 1) 所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值 的平均值（B）除以*個標準（0 標準）的吸 光度值（B0）再乘以 *，即百分吸光度值。 百分吸光度值（%）＝ B ×* B0 以嘔吐毒素標準品濃度值（ppb）為 X 軸，百 分吸光度值為 Y 軸，繪制標準曲線圖。相對應(yīng)每一 個樣品的濃度可以從標準曲線上讀出。也可以用回 歸方程法，計算出樣本溶液濃度。利用計算機專業(yè) 軟件，更便于大量樣品的快速分析。 2） 樣品的實際濃度為讀數(shù)結(jié)果乘以相應(yīng)的稀釋倍 數(shù)。 3） 如果測定值超出檢測范圍，樣品提取溶液按一 定的比例用純水進行稀釋。 8. 注意事項 1) 室溫低于20℃或試劑及樣品未回到室溫（20- 25℃）會導(dǎo)致數(shù)值偏低。 2) 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥過久的情況， 則會出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn) 象。所以洗板排干后應(yīng)立即進行下一步操作。 3) 標準物質(zhì)和顯色液對光敏感，避免直接暴露在 光線下。 4) 混合要均勻，洗板要*（包括加樣品和標準 液的時候都必需充分混合均勻）。 5) 終止液為強酸性物質(zhì)，避免接觸皮膚。 6) 不要使用過了有效期的試劑盒，也不要混合使 用不同批次的試劑盒，這樣會引起測定結(jié)果不 準確。 7) 試劑盒的儲存條件是2-8℃，切勿冷凍。 9. 試劑盒的性能指標 1) 檢測限 LOD: 谷物 0.15ppm（mg/kg），飼料 0.25ppm（mg/kg），發(fā)酵液 0.15ppm（mg/kg）, 尿液 0.05ppm（mg/kg）。（LOD：空白樣品測定 值+2 倍標準偏差 SD） 2) 定量限 LOQ: 谷物 0.25ppm（mg/kg），飼料 0.5ppm（mg/kg），發(fā)酵液 0.25ppm（mg/kg）, 尿液 0.1ppm（mg/kg）。 3) 定 量 檢 測 范 圍 ： 谷 物 0.25-5.0ppm ，飼料 0.5-10.0ppm ， 發(fā) 酵 液 0.25-5.0ppm, 尿 液 0.1-1.0ppm。