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iElisa 磺胺喹噁啉檢測(cè)試劑盒

iElisa 磺胺喹噁啉檢測(cè)試劑盒

1. 概要 磺胺喹嗯啉（sulfaquinoxaline，簡(jiǎn)稱(chēng) SQ）在國(guó) 內(nèi)需求量極大的磺胺類(lèi)高效抗球蟲(chóng)和抗菌藥。由于 養(yǎng)殖場(chǎng)在飼養(yǎng)動(dòng)物過(guò)程中向飼料或動(dòng)物飲用水中 添加，導(dǎo)致其在動(dòng)物源食品中大量殘留。人食用這 些動(dòng)物源食品后可造成磺胺喹噁啉在人體內(nèi)富集， 從而使人發(fā)生過(guò)敏等反應(yīng)，嚴(yán)重的還會(huì)產(chǎn)生致畸、 致癌作用。為此世界各國(guó)均制定了相對(duì)嚴(yán)格的獸藥 殘留標(biāo)準(zhǔn)。 2. 原理 測(cè)定的基礎(chǔ)是抗原-抗體反應(yīng)。微孔板上包被有 偶聯(lián)抗原。加入抗體和磺胺喹噁啉標(biāo)準(zhǔn)品或樣品， 游離的磺胺喹噁啉與偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體，與偶 聯(lián)抗原結(jié)合后的抗體被固定在微孔板上，沒(méi)有結(jié)合 的抗體被洗去，微孔板上的偶聯(lián)物與經(jīng)酶標(biāo)記的二 抗相結(jié)合，加入 TMB 底物顯藍(lán)色，加入終止液后 顏色由藍(lán)變黃，用酶標(biāo)儀在 450nm 處檢測(cè)，吸光值 與樣品中磺胺喹噁啉含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比 較即可得出磺胺喹噁啉殘留物的含量。 3. 試劑盒組成 1) 包被有抗原的96微孔板：1塊（96 孔，12 條×8 孔） 2) 磺胺喹噁啉標(biāo)準(zhǔn)品：0 ng/mL、1.0ng/mL、 5.0ng/mL、20.0ng/mL、50.0ng/m、 l00.0ng/mL、200.0ng/mL 1 瓶 × 1.0mL 3) SQ抗體： 1 瓶 × 10mL 4) 酶標(biāo)二抗： 1 瓶 × 10mL 5) 10× 濃縮洗滌液： 1 瓶 × 50mL 6) 5×復(fù)溶液： 1瓶 × 20mL 7) 稀釋緩沖液： 1瓶 × 50mL 8) 顯色底物： 1 瓶 × 12mL 9) 終止液： 1 瓶 × 7mL 10) 試劑盒說(shuō)明書(shū) 4. 需要的儀器、試劑 1）儀器 —酶標(biāo)儀 450nm —微量移液器 20μL～200μL，100μL～1000μL —天平：感量 0.01g —離心機(jī) —振蕩器 —氮吹儀 —勻質(zhì)器 2） 試劑 —乙酸乙酯 —正己烷 —蒸餾水 5. 工作溶液的配制 1) 洗滌液的配制：將濃縮洗滌液用去離子水稀釋 10 倍后使用（1 份濃縮洗滌液加 9 份蒸餾水）。 2) 復(fù)溶液：用去離子水將 5×濃縮復(fù)溶液按 5 倍稀 釋(1 份濃縮復(fù)溶液加 4 份去離子水) 濃縮復(fù)溶 液如有沉淀析出，用 50℃左右水浴溫?zé)?，沉?將消失 6. 樣品處理 6.1 肉樣 1） 稱(chēng)取 3g 勻質(zhì)肉樣，加入 3mL 水、6mL 乙酸乙 酯，振蕩 20min，3000 轉(zhuǎn)離心 10min。 2） 取 4mL 上層乙酸乙酯于另一干凈離心管中， 60℃氮?dú)獯蹈伞?3） 分別加入 1mL 正己烷、1mL 復(fù)溶液，渦旋 30s， 3000 轉(zhuǎn)離心 10min，取下層用樣品稀釋液 4 倍 （100μL +300μL）稀釋?zhuān)?50μL 用于檢測(cè) 稀釋倍數(shù)：2 6.2 牛奶 1) 取 2g 新鮮牛奶，加入 6mL 乙酸乙酯，振蕩 20min，3000 轉(zhuǎn)離心 10min。 2) 取 1.5mL 上層乙酸乙酯于另一干凈離心管中， 60℃氮?dú)獯蹈伞?3) 分別加入 1mL 正己烷、1mL 復(fù)溶液，渦旋 30s， 離心 3000g，10min，取下層 50μL 用于檢測(cè) 稀釋倍數(shù)：2 6.3 蜂蜜 1) 取2g蜂蜜于離心管中，分別加入4mL水和4mL 乙酸乙酯，振蕩 20min，3000 轉(zhuǎn)離心 10min。取 2.5mL 底液于一干凈試管中吹干，用 1mL 復(fù)溶液復(fù)容。 2) 取 1.0mL 上層乙酸乙酯于另一干凈離心管中， 60℃氮?dú)獯蹈伞?3) 加入 1mL 樣品稀釋液復(fù)容，取 50μL 用于檢測(cè) 稀釋倍數(shù)：2 6.4 雞蛋 1) 稱(chēng)取 2g 勻質(zhì)雞蛋樣品，加入 12mL 乙酸乙酯， 振蕩 20min，3000 轉(zhuǎn)離心 10min。 2) 取 6mL 上層乙酸乙酯，60℃，氮?dú)獯蹈伞?3) 分別加入 1mL 正己烷、1mL 復(fù)溶液，渦旋 30s， 3000 轉(zhuǎn)離心 10min，取下層 50μL 用于檢測(cè) 稀釋倍數(shù)：1 7． 酶聯(lián)免疫分析程序 7.1 測(cè)定之前注意事項(xiàng) 1) 使用前將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）。 2) 使用后迅速將試劑放入 2-8℃冷藏。 3) 在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于 洗板的*性，正確的洗板操作是 ELISA 測(cè)定 程序中的要點(diǎn)。 4) 所有孵育過(guò)程應(yīng)避免陽(yáng)光直射，并按要求用蓋 板覆蓋住酶標(biāo)板。 7.2 測(cè)定程序 1) 將足夠標(biāo)準(zhǔn)品和樣品所用數(shù)量的孔條插入酶 標(biāo)板架，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，記錄 下標(biāo)準(zhǔn)和樣品的位置。未使用的酶標(biāo)板用鋁箔 袋封好置 2-8℃冷藏保存。 2) 分別吸取50μL 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加至相應(yīng)的微孔 （雙孔）中，然后再各加入50μL 的SQ抗體， 裝入袋中密封，室溫溫育30min。 3) 倒出孔中的液體，每孔加入250μL 稀釋好的洗 滌液洗滌，重復(fù)操作四次。洗板時(shí)每次間隔30s， 洗完后用力在吸水紙上排干。 4) 每孔加入酶標(biāo)二抗100μL，室溫避光溫育 20min。 5) 重復(fù)步驟3，反復(fù)洗滌四次。 6) 每孔加入100μL顯色底物，室溫避光溫育 10min。 7) 每孔加入50μL終止液，混勻。 8) 置于酶標(biāo)儀中，振蕩混勻，在450nm處測(cè)定吸 光度值（OD值），參比波長(zhǎng)630nm。（iElisa全 自動(dòng)酶標(biāo)儀可以直接讀出、打印濃度值）。 8. 結(jié)果計(jì)算 1) 所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值 的平均值（B）除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0 標(biāo)準(zhǔn)）的吸 光度值（B0）再乘以 *，即百分吸光度值。 百分吸光度值（%）＝ B ×* B0 以磺胺喹惡啉標(biāo)準(zhǔn)濃度與所獲得的各標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn) 和樣品的平均百分吸光度值值做 log-logit（B/B0 ） 回歸。相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上 讀出。 2） 樣品的實(shí)際濃度為讀數(shù)結(jié)果乘以相應(yīng)稀釋倍 數(shù)。 3） 如果測(cè)定值超出檢測(cè)范圍，樣品提取溶液按一 定的比例用稀釋后的復(fù)溶液進(jìn)行稀釋。 9. 注意事項(xiàng) 1） 室溫低于20℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20- 25℃）會(huì)導(dǎo)致數(shù)值偏低。 2） 在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥過(guò)久的情況， 則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn) 象。所以洗板排干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。 3） 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和顯色液對(duì)光敏感，避免直接暴露在 光線下。 4） 混合要均勻，洗板要*（包括加樣品和標(biāo)準(zhǔn) 液的時(shí)候都必需充分混合均勻）。 5） 反應(yīng)停止液為強(qiáng)酸性物質(zhì)，避免接觸皮膚。 6） 不要使用過(guò)了有效期的試劑盒，也不要稀釋或 攙雜使用不同生產(chǎn)廠家的試劑盒這樣會(huì)引起靈 敏度降低。 7） 試劑盒的儲(chǔ)存條件是2-8℃，切勿冷凍。 10. 檢測(cè)方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度 1) 試劑盒靈敏度: 1.0ppb 2) 試劑盒變異系數(shù)：小于 20%。 3) 試劑盒準(zhǔn)確度：回收率范圍在 70％-120％之 間。