6
英國Kirkstall Quasi Vivo細胞灌流培養(yǎng)系統(tǒng)
Quasi Vivo® 系統(tǒng)有 3 個不同的腔室可用，每個腔室都旨在滿足特定應(yīng)用的需求。 | |||
 |  |  | |
 |  |  | |
允許浸沒式細胞培養(yǎng)，而模塊化特性允許互連細胞共培養(yǎng)。 | 與市售的 transwells 和插入物兼容，使用戶能夠在氣液界面培養(yǎng)細胞并創(chuàng)建液/液屏障模型。 | 由標準多孔板占地面積上的 6 個腔室組成，由幾乎沒有或沒有非特異性結(jié)合的材料制成。 | |
顛fu傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)方式，灌流培養(yǎng)系統(tǒng)
呼吸道上皮細胞的氣液界面培養(yǎng)是研究經(jīng)空氣傳播的病原體，如SARS等的常用的模型。傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式是用TransWell在普通培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。但是此種培養(yǎng)方式無法模擬培養(yǎng)過程中營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物在組織內(nèi)的運輸，培養(yǎng)得到的模型通常有各種各樣的缺陷，并且所需實驗周期較長。
呼吸道上皮細胞的常規(guī)transwell靜止培養(yǎng)方式
| Quais Vivo（QV600）灌流培養(yǎng)系統(tǒng)（腔室+儲液瓶+底座+管道+泵等）
|
而灌流培養(yǎng)系統(tǒng)可為細胞培養(yǎng)提供持久恒定的流動培養(yǎng)環(huán)境，大限度模擬體內(nèi)環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn)，使用系統(tǒng)進行灌流培養(yǎng)與靜態(tài)培養(yǎng)相比，氣液界面培養(yǎng)的呼吸道上皮細胞（正常人氣管上皮細胞 Normal Human BronchialEpithelial Cells，簡稱NHBE；小氣道上皮細胞 Small Airway EpithelialCells，簡稱SAE），發(fā)育分化速度更快，表現(xiàn)為纖毛分化度更高，纖毛運動更強、粘液產(chǎn)生和屏障功能更強。在灌注下加速分化后，將上皮細胞轉(zhuǎn)移到靜態(tài)條件下，并添加抗原呈遞細胞（APC）以研究其在病原體感染后的功能。（ChandorkarP, et al., Fast-track development of an in vitro3D lung/immune cell model to studyAspergillus infections. Sci Rep. 2017 7(1):11644. doi:10.1038/s4-4.）
01、人體內(nèi)所有的細胞都需要營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物的流動 |
02、肺部氣管/支氣管和小氣道上皮結(jié)構(gòu)精細，進行體外 培養(yǎng)模擬體內(nèi)環(huán)境，對呼吸道病原體的研究至關(guān)重要 |
03、采用全新的灌流培養(yǎng)方式培養(yǎng)呼吸道上皮細胞 （采用QV600） |
相比使用transwell靜止培養(yǎng)（StaticConditions),此灌流培養(yǎng)系統(tǒng)（PerfusedConditions）中，呼吸道上皮細胞的生長和分化呈現(xiàn)更好狀態(tài)
04、電鏡照片顯示，采用灌流培養(yǎng)方式（Perfusedconditions）的呼吸道上皮細胞， 分化程度更高 |
05、使用MUC5B染色可以發(fā)現(xiàn)，采用灌流培養(yǎng)方式（Perfusedconditions）的呼吸道上皮細胞，在培養(yǎng)的第7天即可分泌大量粘液。染色可以發(fā)現(xiàn)，細胞間的緊密連接發(fā)育更完善 |
06、使用WGA染色發(fā)現(xiàn)，采用灌流培養(yǎng)方式（Perfusedconditions）的呼吸道上 皮細胞，纖毛分化度更高 |
07、測量TEER（經(jīng)細胞電阻），采用灌流培養(yǎng)方式（Perfusedconditions）的呼吸道上皮細胞TEER值更大，代表得到的上皮細胞膜狀結(jié)構(gòu)更完整 |
Quasi Vivo全球應(yīng)用
全球使用Kirkstall公司灌流培養(yǎng)系統(tǒng)的學(xué)術(shù)及研究機構(gòu)已達70+個，遍布美國、英國、法國、瑞典、奧地利、意大利、荷蘭、瑞士、日本等。目前灌流培養(yǎng)系統(tǒng)已成功用于以下器官模型的培養(yǎng)：
1.呼吸系統(tǒng)（培養(yǎng)熱點）
2. 肝臟
3. 腎臟
4.心血管
5.成纖維細胞
6.糖尿病模型
7.血腦屏障
8.腦組織類器官
一、不同細胞，型號怎么選？
01、單一細胞 QV500：所有腔室培養(yǎng)相同的細胞。
| 02、細胞共培養(yǎng) QV600：每個腔室培養(yǎng)2種或以上細胞。
| QV900：使管路上游的細胞培養(yǎng)基成為下游細胞的條件培養(yǎng)基。
|
流動培養(yǎng)形成含血管的3D心臟組織 | 再生醫(yī)學(xué)
在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，怎樣培養(yǎng)出含血管的組織，是未來應(yīng)用能否成功的關(guān)鍵之一。早期的臨床試驗采用生長因子或細胞注射的方法來修補損傷的心臟，但由于注射細胞造成的炎癥反應(yīng)和局部缺血會在體內(nèi)造成低氧環(huán)境，使得注射的細胞定植率低而死亡率高，不能有效地修復(fù)損傷的心臟功能。
Quasi VivoQV500流動培養(yǎng)系統(tǒng)為接種在明膠支架上的人間充質(zhì)干細胞（hMSCs）和人心肌祖細胞（hCMPC）提供充足的氧氣，促進細胞和營養(yǎng)物質(zhì)向支架核心內(nèi)擴散，并能快速有效地排除組織內(nèi)的代謝廢物，促進血管生成，從而形成由血管樣和心臟樣細胞組成的組織結(jié)構(gòu)密集的適于體內(nèi)移植的原組織。（PagliariS, et al. A multistep procedure to prepare pre-vascularized cardiactissue constructs using adult stem cells, dynamic cell cultures,and porous scaffolds. Frontiers in Physiology. 2014; 5:210）
流動培養(yǎng)系統(tǒng)(QV500型)的蠕動泵將培養(yǎng)基從儲液瓶泵到兩個串聯(lián)的培養(yǎng)腔室內(nèi)， 并能保持恒定流速（200μl/min），保證多孔明膠支架內(nèi)層的培養(yǎng)基流動。 |
構(gòu)建含血管的3D心臟的實驗方案示意圖。明膠多孔支架被浸入稀釋的Matrigel中，然后轉(zhuǎn)移至內(nèi)皮分化培養(yǎng)基中。之后將人間充質(zhì)干細胞接種在支架上，使人間充質(zhì)干細胞定植在支架培養(yǎng)上并向內(nèi)皮進行分化，96小時后，將在聚苯乙烯細胞培養(yǎng)板用心臟分化培養(yǎng)基預(yù)先定型2周的心臟GFP人心肌祖細胞接種于血管化的支架上，用QV500流動培養(yǎng)系統(tǒng)在心臟分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天。 |
采用上述實驗方案，對用QV500培養(yǎng)一周后的共培養(yǎng)結(jié)構(gòu)進行檢測， 發(fā)現(xiàn)在支架上有大量細胞定殖。 |
QV500流動培養(yǎng)條件下支架內(nèi)部浸潤了大量的血管樣細胞（紅色）和人心肌前體細胞 （hCMPC）衍生的心肌細胞（綠色），而靜態(tài)培養(yǎng)條件下，細胞大部分分布在支架表面。 |
免疫組化結(jié)果顯示通過QV500動態(tài)培養(yǎng)可以促進心肌樣細胞（GFP，綠色）和 內(nèi)皮樣細胞（VCAM-1陽性細胞，紅色）向支架內(nèi)部浸潤。 |
(A)切片顯示QV500流動培養(yǎng)的內(nèi)皮樣細胞（VCAM-1陽性細胞，紅色）排列成孔狀，形成管狀結(jié)構(gòu)，并與心肌樣細胞（GFP，綠色）接觸。 （B）QV500流動培養(yǎng)條件下，支架內(nèi)廣泛的細胞分布導(dǎo)致形成密集組裝的多細胞組織，該組織衍生自所用的人間充質(zhì)干細胞（hMSCs）和人心肌前體細胞（hCMPC）。 |
| 總結(jié)：在本文中使用的QV500流動培養(yǎng)系統(tǒng)，能增強氧氣與營養(yǎng)物質(zhì)的運輸，進而增強工程化心血管組織的活性和功能。 與眾不同的流動培養(yǎng)系統(tǒng)，讓日、美、英、法、瑞士、瑞典等全球70多個研究機構(gòu)獲得了更強大的細胞培養(yǎng)工具，在包括呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、肝臟、腎臟、腸道、腦組織類器官，以及糖尿病的研究上更進一步。 | |
流動培養(yǎng)實現(xiàn)血腦屏障三種細胞共培養(yǎng) | 阿爾茨海默病新模型 |
血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的生理和病理中都起著重要的作用。血腦屏障功能異常會引起包括阿爾茨海默癥(AD)等許多神經(jīng)退行性疾病。組成血腦屏障的毛細血管內(nèi)皮細胞（capillaryendothelialcells）、周細胞（pericytes）以及星形膠質(zhì)細胞（astrocytes）間的復(fù)雜的相互作用使得很難在體內(nèi)確定這三種細胞對神經(jīng)毒性各自的貢獻。 |
 | 而流動培養(yǎng)系統(tǒng)可為體外培養(yǎng)這三種細胞提供在不形成屏障的情況下維持細胞間通訊的佳培養(yǎng)環(huán)境。流動培養(yǎng)系統(tǒng)為未來研究不同類型的血腦屏障細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和細胞毒性試驗中的特殊作用提供一個有價值的工具。（Miranda-AzpiazuP, et al. A novel dynamic multicellular co-culture system forstudying individual blood-brain barrier cell types in braindiseases and cytotoxicity testing. Sci Rep. 2018; 8(1):1-10.） |
圖 1.單獨培養(yǎng)的人星形膠質(zhì)細胞（A，GFAP陽性）、周細胞（B，α-actin陽性）、 血管內(nèi)皮細胞（C，CD31陽性）以及血管內(nèi)皮細胞形成的緊密連接（D，ZO1陽性）。 |
圖 2用QV500培養(yǎng)共享相同的培養(yǎng)基的星形膠質(zhì)細胞、周細胞和血管內(nèi)皮細胞的示意圖（A），R為儲液瓶，P為蠕動泵。連接培養(yǎng)基存儲瓶的一個QV500流動培養(yǎng)系統(tǒng)的細胞培養(yǎng)腔室（B）。 |
圖 3 QV500流動培養(yǎng)系統(tǒng)建立的能同時培養(yǎng)三種不同細胞的多細胞共培養(yǎng)體系。 |
圖4幾種流動培養(yǎng)方式示意圖：A圖為單獨星形角質(zhì)細胞流動培養(yǎng)，B圖為單獨周細胞流動培養(yǎng)，C圖為單獨血管內(nèi)皮細胞流動培養(yǎng)，D圖為三種細胞組合后一起流動培養(yǎng)。 |
圖5用MTT法測細胞活力，與靜態(tài)培養(yǎng)相比，采用QV500流動培養(yǎng)系統(tǒng)對單獨培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞（HBECs）、周細胞（HBVPs）、星形角質(zhì)細胞（HAs）（A）或三種細胞共培養(yǎng)（B）的血管內(nèi)皮細胞的細胞活力有明顯升高。 |
圖6用MTT法測細胞活力，與靜態(tài)培養(yǎng)（Static）相比，流動培養(yǎng)（Dynamic）的周細胞（HBVPs）會更早受到Aβ25-35（淀粉樣蛋白β肽的Aβ25-35片段，用于阿爾茨海默病的造模）的毒害。 |
| 總結(jié)：本文中研究者利用QV500流動培養(yǎng)系統(tǒng)建立了三種細胞的共培養(yǎng)。這些細胞不接觸，通過共享培養(yǎng)基實現(xiàn)細胞間的通信，不形成屏障能更好的研究這些細胞類型單獨對不同化合物的響應(yīng)情況。并且研究者還發(fā)現(xiàn)共享相同培養(yǎng)基的星形膠質(zhì)細胞、周細胞和血管內(nèi)皮細胞的適流速為50µl/min。 作為創(chuàng)新的細胞培養(yǎng)方法，Quasi Vivo流動培養(yǎng)已經(jīng)全球70余家zhuanye機構(gòu)使用驗證，獲得了令人側(cè)目的培養(yǎng)效果，在美、英、法、日等多國開展了頗具新意的細胞研究，涉及呼吸系統(tǒng)、肝臟、腎臟、心血管、成纖維細胞、糖尿病模型、腦組織類器官等。 | |
英國Kirkstall Quasi Vivo細胞灌流培養(yǎng)系統(tǒng)