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PCR儀的測序反應(yīng)試驗(yàn)講解
PCR儀進(jìn)行測序反應(yīng)試驗(yàn)時(shí)應(yīng)按照步驟依次進(jìn)行：
1.取0.2ml的PCR管，用記號(hào)筆編號(hào)，將管插在顆粒冰中，加入規(guī)定試劑?？偡磻?yīng)體積5μl，不加輕礦物油或石蠟油，蓋緊PCR管，用手指彈管混勻，稍離心。將PCR管置于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。98℃變性2min后進(jìn)行PCR循環(huán)，PCR循環(huán)參數(shù)為96℃10秒，50℃5秒，60℃4分鐘，25個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增結(jié)束后設(shè)置4℃保溫。
醋酸鈉/乙醇法純化PCR產(chǎn)物：
1.將混合物離心，將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到1.5ml EP管中；
2.加入25μl醋酸鈉/乙醇混合液，充分振蕩，置冰上10min以沉淀DNA。12000r/min于4℃離心30min，小心棄上清；
3.加70%（V/V）的乙醇50μl洗滌沉淀2次。12000r/min于4℃離心5min，小心棄上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10-15min。
電泳前測序PCR產(chǎn)物的處理：
1.加入12μl的TSR于離心管中，劇烈振蕩，讓其充分溶解DNA沉淀，稍離心；
2.將溶液轉(zhuǎn)移至蓋體分離的0.2ml PCR管中，稍離心；
3.在PCR儀上進(jìn)行熱變性（95℃2min），冰中驟冷，待上機(jī)。
具體上機(jī)操作按PCR儀說明書安裝毛細(xì)管，進(jìn)行毛細(xì)管位置的校正，人工手動(dòng)灌膠和建立運(yùn)行的測序順序文件。儀器將自動(dòng)灌膠至毛細(xì)管，1.2kV預(yù)電泳5min，按編程次序自動(dòng)進(jìn)樣，再預(yù)電泳（1.2kV，20min），在7.5kV下電泳2h。電泳結(jié)束后儀器會(huì)自動(dòng)清洗，灌膠，進(jìn)下一樣品，預(yù)電泳和電泳。每一個(gè)樣品電泳總時(shí)間為2.5h。電泳結(jié)束后儀器會(huì)自動(dòng)分析或打印出彩色測序圖譜。
儀器將自動(dòng)進(jìn)行序列分析，并可根據(jù)用戶要求進(jìn)行序列比較。如測序序列已知，可通過序列比較以星號(hào)標(biāo)出差異堿基處，提高工作效率。
測序完畢按PCR儀操作規(guī)程進(jìn)行儀器清洗與保養(yǎng)。