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粗球孢子菌PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)特異性強(qiáng)

PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：

①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；

②堿基配對(duì)原則；

③Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；

④靶基因的特異性與保守性。

原理是由一對(duì)引物介導(dǎo)，能在動(dòng)植物體外對(duì)特定基因(DNA)片斷進(jìn)行快速酶促擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)n個(gè)熱循環(huán)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物中所含特定基因數(shù)是原始模板數(shù)的(1+E)n(0＜E＜1,擴(kuò)增效率＝倍，使得檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中的特定基因成為可能。

適用范圍【參考值】

1.試劑盒有效性判定：

（1）陽(yáng)性對(duì)照：有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35。

（2）陰性對(duì)照：Ct值＞38或無(wú)Ct值，線形為直線或輕微斜線，無(wú)指數(shù)增長(zhǎng)期。

2.標(biāo)本結(jié)果判定：

（1）陽(yáng)性：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期。

（2）可疑：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時(shí)應(yīng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，則判定為陽(yáng)性，否則為陰性。

（3）陰性：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值＞38或無(wú)Ct值。

PCR實(shí)驗(yàn)步驟:

典型的PCR由（1）高溫變性模板；（2）引物與模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反應(yīng)組成一個(gè)循環(huán)，通過(guò)多次循環(huán)反應(yīng)，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。

其主要步驟是：

將待擴(kuò)增的模板DNA置高溫下（通常為93℃-94℃）使其變性解成單鏈；

人工合成的兩個(gè)寡核苷酸引物在其合適的復(fù)性溫度下分別與目的基因兩側(cè)的兩條單鏈互補(bǔ)結(jié)合，兩個(gè)引物在模板上結(jié)合的位置決定了擴(kuò)增片段的長(zhǎng)短；

耐熱的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃將單核苷酸從引物的3’端開(kāi)始摻入，以目的基因?yàn)槟０鍙?’→3’方向延伸，合成DNA的新互補(bǔ)鏈。

下列是公司正在*的產(chǎn)品：

Myc tag antibody (FITC)原裝、分裝牛膽鹽Bile Salt (Bovine)

Myc tag antibody (FITC)原裝、分裝牛血清白蛋白Ⅴ（不含脂肪）

GAL4 antibody - ChIP Grade原裝、分裝Adenosine 腺苷

GABARAP antibody原裝、分裝Cytidine 胞苷(胞嘧啶核苷）

Syndecan-1 antibody [B-A38], prediluted原裝、分裝可溶性兩性B Amphotericin B

E Cadherin antibody [HECD-1]原裝、分裝Aprotinin 蛋白酶抑制（抑肽酶）

CD55 antibody [MEM-118]原裝、分裝Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶

TRF1 antibody - ChIP Grade原裝、分裝復(fù)合蛋白酶Hsp60 antibody [EP1006Y] - Loading Control原裝、分裝位庚內(nèi)酯(Standard for GC ,>98.5%(GC))

Hsp60 antibody [EP1006Y] - Loading Control原裝、分裝(+)-葑(standard for GC, ≥99.5% (GC))

CD22 (phospho Y762) antibody [EP727Y]原裝、分裝(+)-葑(standard for GC, ≥99.5% (GC))

CD22 (phospho Y762) antibody [EP727Y]原裝、分裝二醇醚(Standard for GC,≥99.5%(GC))

CD22 (phospho Y762) antibody [EP727Y]原裝、分裝醇(GCS,>99.8%(GC))

Crk p38 antibody [EP242Y]原裝、分裝酯(Standard for GC,≥99.7%(GC))

Crk p38 antibody [EP242Y]原裝、分裝異苯(Standard for GC,>99.5%)

Crk p38 antibody [EP242Y]原裝、分裝異辛(Standard for GC,≥99.5%(GC))

Vitronectin/S-Protein antibody [EP873Y]原裝、分裝異酯(standard for GC,≥99.5%（GC）)
粗球孢子菌PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)Recombinant mouse Noggin protein原裝、分裝肥大細(xì)胞脫粒肽HR-2

Recombinant mouse Noggin protein原裝、分裝黃蜂毒素

Recombinant human TIMP1 protein原裝、分裝黃蜂毒素7

Recombinant mouse CTF2 protein原裝、分裝黃蜂毒素 X

Recombinant mouse CTF2 protein原裝、分裝交配子aSK2

Aprotinin antibody [35]原裝、分裝乳性蛋白激酶底物

Citrate transport protein antibody原裝、分裝乳性蛋白（1-11），人

Recombinant human DKK1 protein原裝、分裝乳性蛋白（1-11），小鼠

Recombinant human DKK1 protein原裝、分裝乳性蛋白（1-17）

實(shí)驗(yàn)過(guò)程：

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。

10×PCR buffer             5μl

dNTP mixl                 4μl

引物1（10pM）               2μl

引物2（10PM）              2μ

Taq酶（2U/μl）            1μl

DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

加ddH2O至               50 μl

視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。

4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)

三、注意事項(xiàng)

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。好設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。

２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。