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詳細(xì)介紹
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
EHA101
菌株為C58型背景，核基因中含有篩選標(biāo)簽
——利f平抗性基因Rif，為了便于轉(zhuǎn)化操作，
此菌株攜帶一無(wú)自身轉(zhuǎn)運(yùn)功能的胭脂堿型
Ti 質(zhì)粒 pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)，此質(zhì)粒含有 vir 基
因 (vir 基因是
T-DNA 插入植物基因組必需的元件，
pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)質(zhì)粒自身的 T
DNA 轉(zhuǎn)移功能被破壞，但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體
T-DNA 順利轉(zhuǎn)移)。pEHA101 (pTiBo542DT
DNA)
型 Ti 質(zhì)粒含有篩選標(biāo)簽：
Kan，賦予 EHA101 菌株卡那m素抗性，適用于玉米、水稻、煙草
等植物的轉(zhuǎn)基因操作。
本公司
開(kāi)發(fā)的 EHA101 電轉(zhuǎn)感受態(tài)特別適用于大質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化：經(jīng) pK7WGF2
質(zhì)粒
(壯觀m素抗性，
size:11876 bp)檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>105cfu/μg DNA。
產(chǎn)品組成
組分
EHA101
電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞
10 × 50μL
100 × 50μL
定制
基因型：C58
(RifR ) Ti pEHA101 (pTiBo542 D T-DNA) (KanR ) Nopaline
存儲(chǔ)條件
-80 ℃
保存；請(qǐng)勿將本品置于-20 ℃或者液氮中保存。
質(zhì)量控制
除胭脂堿型 Ti 質(zhì)粒 pEHA101 外，無(wú)外源質(zhì)粒 DNA 殘留；
電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)化效率
≥105cfu/μg
DNA。
使用方法
1. 將新的
2 mm 電擊杯插入冰中預(yù)冷；或者將儲(chǔ)存于
75%乙醇中的 2 mm 電擊杯和杯蓋取出，在超凈工
作臺(tái)中將其倒
置于干凈的吸水紙上，使乙醇充分揮發(fā)，
然后插入冰中預(yù)冷；
2. 取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)插入冰中待其融化，加入
0.01-1 μg質(zhì)粒 DNA（體積不大于 5 μl），用 200
μl 槍頭將感受態(tài)-質(zhì)粒混合物快速轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的電擊杯中，蓋上杯蓋；
3. 開(kāi)啟電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置參數(shù)（2500 V ，200 Ω，25 μF），將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中，電擊完成后快速插
入冰中，加入 900 μl 無(wú)抗生素的 YEB 并將感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到無(wú)菌空管中，28 ℃振蕩培養(yǎng) 2~3 小時(shí)。
（注：此電轉(zhuǎn)化參數(shù)為 Bio-rad 推薦，使用者也可使用電轉(zhuǎn)儀所推薦的 Protocol 進(jìn)行操作）
4. 6000 rpm 離心一分鐘收菌，留取 100 μl 左右上清將菌體輕輕吹勻，并涂布于含相應(yīng)抗生素的 YEB 平
板上，倒置放于 28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 2~3 天（當(dāng)平板只含有轉(zhuǎn)化所用雙元載體抗生素時(shí)，28℃培養(yǎng) 48 小時(shí)
即可；平板中同時(shí)加入雙元載體抗生素，20μg/ml Rif 時(shí)，需 28℃培養(yǎng) 60h；如果使用的平板含有 50
μg/ml rif 則需要 28℃培養(yǎng) 72-90 小時(shí)）。
注意事項(xiàng)
1. 感受態(tài)細(xì)胞解凍后應(yīng)立即使用；
2. 加入的待轉(zhuǎn)化 DNA 的總體積不應(yīng)超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的 1/10；
3. 利f平濃度不應(yīng)高于 25 μg /μl，利f平濃度過(guò)高不利于農(nóng)桿菌生長(zhǎng)，會(huì)降低其生長(zhǎng)速度和轉(zhuǎn)化效率。
4. 由于 Ti 質(zhì)粒丟失的概率極低（可以忽略），所以相關(guān)抗性基因可以不用添加。
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