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Precellys Evolution—蛋白質(zhì)樣本制備理想方案

閱讀：1563 發(fā)布時間：2020-11-2

蛋白質(zhì)是生命的基石，它們幾乎在地球的每一種生物中都能被找到，對我們的生存很重要。一些蛋白質(zhì)例如抗體、酶、激素等會參與化學(xué)反應(yīng)免疫過程以及細(xì)胞活動。蛋白質(zhì)還在運(yùn)動、結(jié)構(gòu)支持、存儲能量、細(xì)胞消化、底物運(yùn)輸?shù)确矫嫫鹱饔?。蛋白質(zhì)由長鏈氨基酸組成，形成多種多樣，不同形狀大小的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)因為其不同的長鏈氨基酸組成，每一種類型都有穩(wěn)定特別的三維結(jié)構(gòu)。這種特殊的結(jié)構(gòu)是至關(guān)重要的，每一個形狀的改變都會引起蛋白質(zhì)功能的變化。所以說像蛋白質(zhì)這種對熱敏感的分子，在分子下游分析過程之前的樣品制備就顯得格外重要。Precellys Evolution結(jié)合Cryolys Evolution冷卻系統(tǒng)能夠有效的在研磨過程中使研磨腔室溫度穩(wěn)定保持在4℃。

使用Precellys提高組織蛋白質(zhì)的提取量

APPNOTE 1：從大鼠皮膚組織提取蛋白質(zhì)沉淀和脂肪

APPNOTE 2：使用Minilys從小鼠心臟組織從提取蛋白質(zhì)

Protocol 1：大體積大腸桿菌中提取蛋白質(zhì)

Protocol 2： 96通道眼睛組織中提取蛋白質(zhì)

APPNOTE 1

從*勻質(zhì)的大鼠皮膚組織中提取蛋白質(zhì)沉淀和脂肪

本應(yīng)用中研究了從大鼠皮膚組織中提取蛋白質(zhì)沉淀和有生物活性的脂肪。本應(yīng)用中利用固相萃取與液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）來測組織中脂肪含量。大鼠皮膚組織使用Precellys Evolution生物樣品研磨器和Cryolys冷卻系統(tǒng)進(jìn)行研磨，配合7mlCKMix50_研磨管。此外還測試了在大鼠組織整個研磨的過程結(jié)束后，樣本溫度都在40℃以下。

實驗材料

自動研磨器：Precellys Evolution生物樣品研磨器和Cryolys冷卻系統(tǒng)；

研磨管：CKMix50_7ml（Cat #: KT03961-1-306.7）；

組織樣本：大鼠皮膚組織（后足背側(cè)和腹側(cè)）；

干冰；

Buffer：甲醇。

實驗方法

20-90mg成年大鼠皮膚組織（后足背側(cè)和腹側(cè)），7ml研磨管加2.8mm和5.0mm陶瓷珠，500µL甲醇；轉(zhuǎn)速8000rpm，5個循環(huán)，每個循環(huán)10s，循環(huán)之間間歇120s；Cryolys冷卻系統(tǒng)將腔室內(nèi)溫度降至5℃時開始研磨；研磨結(jié)束之后立即使用溫度探針檢測樣本管內(nèi)的溫度。

實驗結(jié)果

如下圖1、2所示，圖1中a、b分別為研磨前與研磨后效果對比，結(jié)果顯示皮膚樣本被充分研磨；圖2為樣本被勻質(zhì)后經(jīng)過固相萃取，用LC-MS/MS技術(shù)檢測，成功檢測到花生四烯酸，5-HETE、8-HETE、9-HETE的濃度分別為1.3 ±0.3、7.9±0.6和1.3 ± 0.4 ng/mg。

實驗結(jié)論

大鼠的后爪皮膚比背部皮膚厚，因此獲得其完整勻質(zhì)的難度更大，使用Precellys Evolution生物樣品研磨器，結(jié)合Precellys裂解試劑盒成功研磨大鼠后爪皮膚組織。本應(yīng)用同樣也展示了Cryolys冷卻系統(tǒng)能夠保證樣本溫度在40℃以下。

APPNOTE 2

使用Minilys從小鼠心臟組織中提取蛋白質(zhì)

開曼化學(xué)研究和生產(chǎn)抗體，為了營造更好的研究市場。為了保證質(zhì)量，需要合適的組織裂解產(chǎn)物來確保我們的產(chǎn)品達(dá)到或者超過我們質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)。我們很多目標(biāo)蛋白都是多通道跨膜受體，因此需要一個非常強(qiáng)力的裂解系統(tǒng)。

實驗材料

Minilys生物樣品研磨器；CKMix 2mL (KT03961-1-009.2)研磨管；920mg小鼠心臟組織；裂解Buffer：920µL M-PER (Mammalian Protein Extraction Reagent, Pierce)。

實驗方法

Minilys研磨參數(shù)：研磨速率5000rpm；4個循環(huán)，每個循環(huán)20s，循環(huán)之間間歇5s；

分析方法：使用Minilys研磨樣本之后，從中提取細(xì)胞質(zhì)和膜蛋白；HEK 293細(xì)胞（S1P3轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染）在細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)，隨后提取蛋白質(zhì)；所有的蛋白通過BCA法測定，溶菌產(chǎn)物通過Western Blot分析。

結(jié)果如圖所示：圖1為使用S1P3多克隆抗體；一列為3µLMark，第二列為2.5μgS1P3轉(zhuǎn)染過的HEK293細(xì)胞裂解產(chǎn)物，第三列為5μgS1P3轉(zhuǎn)染過的HEK293細(xì)胞裂解產(chǎn)物，第4列為50μg小鼠心臟膜蛋白裂解產(chǎn)物。結(jié)果顯示均有很好的條帶，研磨提取效果好。圖2為使用一種視神經(jīng)多克隆抗體（C-Terminal）；一列為3µLMark，第二列為60μgHEK293細(xì)胞裂解產(chǎn)物，第三列為40μgHEK293細(xì)胞裂解產(chǎn)物，第四列為50μg小鼠心臟細(xì)胞質(zhì)裂解產(chǎn)物，第五列為小鼠心臟膜蛋白裂解產(chǎn)物，結(jié)果顯示均有很好條帶，研磨提取效果好。