“基因治療作為一種新興的治療方法，在遺傳性疾病、癌癥等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大潛力。LNPs作為非病毒基因載體，具有安全性高、制備簡便等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于核酸遞送。LNPs的設(shè)計(jì)關(guān)鍵在于可電離脂質(zhì)的選擇，其理化性質(zhì)直接影響LNP的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率。本研究旨在比較不同臨床用可電離脂質(zhì)在LNP介導(dǎo)的DNA遞送中的性能，為優(yōu)化LNP基因載體提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。"
圖一、DNA/LNP的設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證模型
實(shí)驗(yàn)材料
結(jié)果
2.1 LNP理化性質(zhì)表征：
本研究中，針對RNA遞送設(shè)計(jì)的LNP脂質(zhì)組成被評估其用于結(jié)合DNA表達(dá)質(zhì)粒的潛力。所生成的DNA-LNP的脂質(zhì)組成包括：1) 可電離脂質(zhì)，2) 膽固醇，3) 輔助脂質(zhì)，和4) PEG偶聯(lián)脂質(zhì)，摩爾比為50:39:10:1（圖1A）。比較了三種臨床上使用的可電離脂質(zhì)，即DLin-MC3-DMA（MC3）、SM-102和ALC-0315。通過微流控混合技術(shù)封裝納米質(zhì)粒DNA后，對DNA-LNP進(jìn)行了表征。所有DNA-LNP制劑均在N/P比為6（即可電離脂質(zhì)與DNA的電荷比）的條件下生成。表征結(jié)果顯示，所有制劑均呈現(xiàn)出適宜的粒徑和ζ電位，確保了它們的穩(wěn)定性和細(xì)胞內(nèi)攝取潛力。
圖二、DNA/LNP的表征
2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率與基因表達(dá)：
為了評估LNP封裝的DNA的細(xì)胞攝取，使用Cy3標(biāo)記了編碼EGFP的納米質(zhì)粒DNA，并將其與HuH-7和mPH細(xì)胞孵育。DNA-LNP以10至50ng DNA/cm2的最終濃度添加，并孵育至72小時(shí)。通過流式細(xì)胞術(shù)和共聚焦顯微鏡分析細(xì)胞攝取和轉(zhuǎn)基因表達(dá)。在HuH-7細(xì)胞中，MC3 LNPs顯示出最高的EGFP表達(dá)水平，約60%的細(xì)胞表達(dá)了EGFP，而ALC-0315 LNPs的表達(dá)水平略低（40%）。在mPH細(xì)胞中，由于強(qiáng)自發(fā)熒光，選擇了tdTomato作為報(bào)告基因進(jìn)行成像。SM-102 LNPs在此細(xì)胞系中表現(xiàn)出優(yōu)勢，有7%的細(xì)胞表達(dá)了tdTomato，而ALC-0315 LNPs的表達(dá)水平顯著降低。通過實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）量化了DNA拷貝數(shù)的遞送。DNA-LNP孵育24小時(shí)后，使用QIAprep Spin Mini-prep Kit提取遞送的DNA，并制備DNA校準(zhǔn)曲線以計(jì)算拷貝數(shù)。結(jié)果顯示，在HuH-7細(xì)胞中，MC3 LNPs遞送的DNA拷貝數(shù)最高，而在mPH細(xì)胞中，SM-102 LNPs顯示出最高的遞送效率。
圖四、DNA/LNP的體外轉(zhuǎn)染評價(jià)
2.3 生物分布分析：
通過尾靜脈注射向野生型小鼠體內(nèi)遞送了封裝有20µg DNA的DNA-LNPs，并在24小時(shí)后處死小鼠以評估生物分布和轉(zhuǎn)基因表達(dá)。器官被收集、勻漿，并通過qPCR確定遞送的DNA拷貝數(shù)。結(jié)果顯示，肝臟和肺臟中積累了最高比例的熒光素酶DNA，分別為11.3±2.8%和7.5±1.9%的注射劑量（ID），而脾臟中的積累水平較低（2.6±0.7% ID）。這一趨勢在所有DNA-LNP制劑中均一致觀察到。體內(nèi)轉(zhuǎn)基因表達(dá)通過生物發(fā)光成像進(jìn)行評估。在注射DNA-LNPs 24小時(shí)后，向小鼠腹腔注射d-熒光素，并使用生物成像系統(tǒng)監(jiān)測生物發(fā)光。結(jié)果顯示，MC3和SM-102 LNPs在肝臟中誘導(dǎo)了顯著的熒光素酶表達(dá)，而ALC-0315 LNPs的表達(dá)水平較低。這些結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了MC3和SM-102 LNPs在DNA遞送和轉(zhuǎn)基因表達(dá)方面的優(yōu)勢。
圖五、DNA/LNP在小鼠中的體內(nèi)分布和表達(dá)討論
本研究表明，臨床用LNP制劑在設(shè)計(jì)用于DNA基因遞送時(shí)，需進(jìn)行先期評估?？呻婋x脂質(zhì)的選擇對LNP的理化性質(zhì)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和基因表達(dá)水平具有重要影響。含有ALC-0315的LNP在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平，這可能與其有利的理化性質(zhì)、良好的細(xì)胞攝取和基因遞送能力有關(guān)。然而，SM-102在某些細(xì)胞系中表現(xiàn)出更高的DNA遞送量和熒光強(qiáng)度，提示在不同細(xì)胞環(huán)境中可能需要選擇不同的可電離脂質(zhì)以優(yōu)化基因遞送效果。此外，LNP的粒徑、電荷等理化性質(zhì)對細(xì)胞攝取和基因遞送具有重要影響。本研究中，含有ALC-0315的LNP粒徑小于100nm，有利于細(xì)胞攝取和基因遞送。未來研究可進(jìn)一步探索LNP理化性質(zhì)與基因遞送效率之間的關(guān)系，以優(yōu)化LNP設(shè)計(jì)。
結(jié)論
本研究通過比較不同臨床用可電離脂質(zhì)在LNP介導(dǎo)的DNA遞送中的性能，發(fā)現(xiàn)含有ALC-0315的LNP在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平。這一發(fā)現(xiàn)為LNP在DNA基因治療中的應(yīng)用提供了有價(jià)值的見解，為未來優(yōu)化LNP基因載體提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。未來研究可進(jìn)一步探索LNP理化性質(zhì)、細(xì)胞攝取、基因遞送效率之間的復(fù)雜關(guān)系，以推動LNP在基因治療領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。參考文獻(xiàn)：Lotter, Claudia, et al. "Comparison of ionizable lipids for lipid nanoparticle mediated DNA delivery." European Journal of Pharmaceutical Sciences 203 (2024): 106898.
