“本文探討了微反應(yīng)器在脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）制備中的應(yīng)用，重點(diǎn)研究了混合時(shí)間、顆粒形態(tài)及其對(duì)mRNA遞送效率的影響。通過優(yōu)化混合條件，在T型微反應(yīng)器和環(huán)形微反應(yīng)器中均成功制備了具有相似尺寸、mRNA包封效率和空載LNP比例的mRNA負(fù)載LNPs。值得注意的是，兩種微反應(yīng)器制備的LNPs在泡狀結(jié)構(gòu)（bleb）的比例上存在顯著差異。T型微反應(yīng)器產(chǎn)生了更高比例的泡狀LNPs，與mRNA完整性略有增強(qiáng)相關(guān)，而環(huán)形微反應(yīng)器主要形成球形LNPs。體內(nèi)外研究表明，球形和小尺寸的LNPs展現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)染效率，而泡狀LNPs在體內(nèi)維持了更長的mRNA表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)為設(shè)計(jì)和優(yōu)化針對(duì)特定治療和開發(fā)需求的微反應(yīng)器提供了有價(jià)值的見解。"
示意圖
結(jié)果與討論
1.1 LNP的制備與表征：
實(shí)驗(yàn)采用兩種不同類型的微反應(yīng)器——T型微反應(yīng)器和環(huán)形微反應(yīng)器，來制備mRNA負(fù)載的LNPs。首先，將含有mRNA的水溶液（檸檬酸鈉緩沖液，pH=4）與基于乙醇的脂質(zhì)溶液分別通過注射泵注入微反應(yīng)器中。在微反應(yīng)器內(nèi)部，這兩種溶液迅速混合，形成LNPs。通過優(yōu)化操作條件，如總流速和流速比，實(shí)現(xiàn)了對(duì)LNP尺寸、形態(tài)和mRNA包封效率的有效控制。為了對(duì)制備的LNP進(jìn)行表征，采用了多種技術(shù)手段。通過動(dòng)態(tài)光散射（DLS）測量了LNPs的粒徑分布，結(jié)果顯示，在快速混合條件下，兩種微反應(yīng)器均能夠制備出尺寸較小且分布均勻的LNPs。此外，還利用低溫透射電子顯微鏡（Cryo-TEM）對(duì)LNPs的形態(tài)進(jìn)行了觀察。Cryo-TEM圖像清晰地展示了LNPs的球形結(jié)構(gòu)，以及在部分LNP表面存在的泡狀結(jié)構(gòu)（bleb）。
圖一、混合結(jié)構(gòu)示意圖，A-環(huán)型，B-T型
圖二、不同混合結(jié)構(gòu)在不同混合條件下的混合效率評(píng)價(jià)
1.2 混合時(shí)間對(duì)LNP形成的影響：
混合時(shí)間是影響LNP形成的關(guān)鍵因素之一。為了評(píng)估混合時(shí)間對(duì)LNP制備過程的影響，計(jì)算了Damk?hler數(shù)（Da），它表示混合時(shí)間（t_m）與特征聚集時(shí)間（t_agg）的比值。當(dāng)Da<1時(shí)，表明處于快速混合狀態(tài)，此時(shí)混合過程對(duì)納米顆粒的形成影響較小。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在兩種微反應(yīng)器中，隨著總流速的增加，Damk?hler數(shù)逐漸減小，最終趨于穩(wěn)定，說明混合性能足以滿足LNP制備的需求。通過比較兩種微反應(yīng)器的微混合時(shí)間（t_m）與雷諾數(shù)（Re）的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)T型微反應(yīng)器在較高的雷諾數(shù)下表現(xiàn)出更高的混合效率。這表明，在快速混合區(qū)域操作時(shí)，T型微反應(yīng)器能夠更有效地實(shí)現(xiàn)兩種溶液的均勻混合，從而有利于形成更小、更均勻的LNPs。
圖三、不同混合結(jié)構(gòu)在不同流速條件下制備得到的LNP的理化性質(zhì)評(píng)價(jià)
1.3 LNP的形態(tài)與結(jié)構(gòu)：
進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，兩種微反應(yīng)器制備的LNPs在形態(tài)上存在顯著差異。具體而言，環(huán)形微反應(yīng)器制備的LNPs中泡狀結(jié)構(gòu)更為普遍，而T型微反應(yīng)器制備的LNPs則相對(duì)更光滑、球形度更高。這種形態(tài)上的差異可能與微反應(yīng)器的幾何結(jié)構(gòu)以及混合過程中的流體動(dòng)力學(xué)效應(yīng)有關(guān)。為了揭示LNP形成過程中的機(jī)制，對(duì)制備過程進(jìn)行了詳細(xì)的考察。結(jié)果表明，在微反應(yīng)器中，mRNA水溶液與乙醇基脂質(zhì)溶液迅速混合后，形成了初步的LNP核。隨后，在稀釋過程中，脂質(zhì)和mRNA進(jìn)一步遷移，最終形成了具有泡狀結(jié)構(gòu)的LNPs。這一發(fā)現(xiàn)為理解LNP的形態(tài)演變提供了重要線索。
圖五、不同混合結(jié)構(gòu)制備的LNP的結(jié)構(gòu)表征
1.4 mRNA遞送效率：
為了評(píng)估不同特性LNPs的mRNA遞送效率，選擇了四種具有代表性的LNPs進(jìn)行了細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，盡管這些LNPs在制備條件、微通道幾何形狀等方面存在差異，但它們的mRNA包封效率卻相近。然而，在細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)T型微反應(yīng)器制備的LNPs（LNP-T）被HepG2細(xì)胞攝取的速度較慢于環(huán)形微反應(yīng)器制備的LNPs（LNP-R）。這一結(jié)果表明，LNP的形態(tài)結(jié)構(gòu)可能影響其細(xì)胞攝取效率。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，LNP-R具有更高的球形度和更少的泡狀結(jié)構(gòu)，這可能使其更容易被細(xì)胞識(shí)別和攝取。此外，LNP-R還表現(xiàn)出更高的體外轉(zhuǎn)染效率，特別是在低劑量下。這些結(jié)果提示我們，通過優(yōu)化LNP的形態(tài)結(jié)構(gòu)，可以進(jìn)一步提高其mRNA遞送效率。
圖八、不同樣品的體內(nèi)細(xì)胞表達(dá)表征
結(jié)論
本研究系統(tǒng)地探討了T型微反應(yīng)器和環(huán)形微反應(yīng)器中mRNA負(fù)載LNPs的制備過程，并評(píng)估了混合時(shí)間、顆粒形態(tài)對(duì)mRNA遞送效率的影響。結(jié)果表明，通過優(yōu)化微反應(yīng)器設(shè)計(jì)、操作條件和配方選擇，可以優(yōu)化mRNA遞送系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)快速起效與持續(xù)表達(dá)的平衡，為特定治療應(yīng)用提供有力支持。未來研究將進(jìn)一步探索LNP結(jié)構(gòu)與其生物學(xué)性能之間的精確關(guān)系，以及如何通過微反應(yīng)器技術(shù)實(shí)現(xiàn)更精確的控制和優(yōu)化。
參考文獻(xiàn)：Chen, D., Liu, Z., Guo, L., et al. (2025). Controlled preparation of lipid nanoparticles in microreactors: Mixing time, morphology and mRNA delivery. Chemical Engineering Journal, 505, 159318. [DOI: 10.1016/j.cej.2025.159318]
