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實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀操作流程

閱讀:146      發(fā)布時(shí)間:2025-2-11
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  實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的基本原理是利用DNA聚合酶在PCR過程中合成新DNA鏈的特性,結(jié)合一種熒光標(biāo)記的探針或染料,通過實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光信號的增加來測量PCR反應(yīng)的進(jìn)行程度。在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因,利用熒光信號累積實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程。隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行,監(jiān)測到的熒光信號的變化可以繪制成一條曲線。
 
  由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期,模板的Ct值(即樣品到達(dá)域值水平所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系,所以可以作為定量的依據(jù)。域值應(yīng)設(shè)定在使指數(shù)期的擴(kuò)增效率為最大,這樣可以獲得最準(zhǔn)確、可重復(fù)性的數(shù)據(jù)。如果同時(shí)擴(kuò)增的還有標(biāo)有相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,線性回歸分析將產(chǎn)生一條標(biāo)準(zhǔn)曲線,可以用來計(jì)算未知樣品的濃度。
 
  使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的一般操作流程包括:
 
  設(shè)計(jì)引物和探針:根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模x擇合適的基因序列,設(shè)計(jì)特異性引物和熒光探針。
 
  準(zhǔn)備樣本:提取待檢測的核酸樣本,如DNA或RNA,并確保樣本的質(zhì)量和純度。
 
  準(zhǔn)備反應(yīng)體系:將所需的試劑和樣本加入PCR反應(yīng)管中,組成反應(yīng)體系。包括引物、探針、酶、緩沖液、dNTPs和核酸模板等。
 
  設(shè)置儀器參數(shù):打開儀器,選擇合適的PCR程序,并根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)置溫度、時(shí)間、循環(huán)次數(shù)等參數(shù)。同時(shí),設(shè)置熒光檢測通道和參數(shù)。
 
  放置樣本:將準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管放入儀器的樣品槽中,確保放置正確且穩(wěn)固。
 
  啟動程序:確認(rèn)設(shè)置無誤后,啟動PCR程序。儀器將按照設(shè)定參數(shù)進(jìn)行溫度循環(huán)和熒光檢測。
 
  實(shí)時(shí)監(jiān)測與分析:通過儀器顯示屏實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光信號變化,觀察擴(kuò)增曲線形狀和趨勢。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,儀器自動生成結(jié)果,包括擴(kuò)增曲線、Ct值等。使用軟件對結(jié)果進(jìn)行分析和處理。

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