CCK-8檢測實驗(細(xì)胞活力檢測實驗)是一種常用的細(xì)胞增殖和毒性檢測方法,通過測量細(xì)胞內(nèi)酶活性的變化,從而來評估細(xì)胞的活力。CCK-8檢測是一種簡便、快速、高靈敏度的細(xì)胞活力檢測方法,適用于多種細(xì)胞類型和實驗條件。本文主要從實驗原理、實驗步驟、注意事項等方面來介紹該實驗。
一、實驗原理
該試劑中含有WST-8,它在電子載體(1-Methoxy PMS)的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚染料formazan,生成的甲瓚物formazan的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比,因此可以用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。
活力計算:
細(xì)胞活力*(%)=[A(加藥)—A(空白)]/[A(0加藥)—A(空白)] ×100
A(加藥):具有細(xì)胞、CCK8溶液和藥物溶液的孔的吸光度
A(空白):具有培養(yǎng)基和CCK8溶液而沒有細(xì)胞的孔的吸光度
A(0加藥):具有細(xì)胞、CCK8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度
*細(xì)胞活力:細(xì)胞增殖活力或細(xì)胞毒性活力。
二、實驗步驟
1. 實驗前將細(xì)胞接種96孔板,每組鋪5個平行孔(孔的外圍一圈加PBS,以防邊緣效應(yīng)影響實驗組),在96孔板中配置100μl的細(xì)胞懸液,將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24小時。
2. 進(jìn)行CCK-8實驗,棄掉孔內(nèi)原有培養(yǎng)基并每孔加入新配制的含有終體積1/10 CCK-8試劑盒的完quan培養(yǎng)基,37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4hr(根據(jù)細(xì)胞量決定時間長短,細(xì)胞越多OD值越大且隨著孵育時間的延長OD值也會變大,最適OD值應(yīng)保持在2以內(nèi))。
3. 在450nm處測定吸光值。
4. 計算細(xì)胞增殖率:(實驗組OD-空白組OD)/(對照組OD-空白組OD)
三、注意事項
1. 細(xì)胞接種密度要適中,過低或過高的密度都會影響實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。
2. CCK-8試劑的添加量要適量,過多或過少都會影響實驗結(jié)果。
3. 培養(yǎng)時間要適當(dāng),過長或過短的培養(yǎng)時間都可能導(dǎo)致實驗結(jié)果的偏差。
4. 測定吸光度時,要確保酶標(biāo)儀的校準(zhǔn)準(zhǔn)確,以獲得可靠的實驗數(shù)據(jù)。
5.如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話,可在加CCK8之前更換新鮮培養(yǎng)基(除去培養(yǎng)基,并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次,然后加入新的培養(yǎng)基),去掉藥物影響。當(dāng)然藥物影響比較小的情況下,可以不更換培養(yǎng)基,直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。
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