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一、工作原理

RNA酶保護(hù)法（RNase Protection Assay，RPA，以下簡(jiǎn)稱RPA），是近十年發(fā)展起來的一種全新的mRNA定量分析方法。

基本原理：將標(biāo)記的特異RNA探針（32P或生物素）與待測(cè)的RNA樣品液相雜交，標(biāo)記的特異RNA探針按堿基互補(bǔ)的原則與目的基因特異性結(jié)合，形成雙鏈RNA；未結(jié)合的單鏈RNA經(jīng)RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸，而待測(cè)目的基因與特異RNA探針結(jié)合后形成雙鏈RNA，免受RNA酶的消化，故該方法命名為RNA酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)。

二、RPA法優(yōu)點(diǎn)

與Northern blot和RT-PCR比較，RPA有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：

1. 檢測(cè)靈敏度比Northern雜交高。

由于Northern雜交步驟中轉(zhuǎn)膜和洗膜都將造成樣品和探針的損失，使靈敏度下降，而RPA將所有雜交體系進(jìn)行電泳，故損失小，提高了靈敏度。

2. 由于PCR擴(kuò)增過程中效率不均一和反應(yīng)“平臺(tái)"問題，基于PCR產(chǎn)物量進(jìn)行分析所得數(shù)據(jù)的可靠性將下降，而RPA沒有擴(kuò)增過程，因此，分析的數(shù)據(jù)真實(shí)性較高。

3.由于與反義RNA探針雜交的樣品RNA僅為該RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA樣品仍可進(jìn)行分析。

4.步驟較少，耗時(shí)短。與Northern雜交相比，省去了轉(zhuǎn)膜和洗膜的過程。

5.RNA-RNA雜交體穩(wěn)定性高，無探針自身復(fù)性問題，無須封閉。

6.一個(gè)雜交體系中可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)探針雜交，無競(jìng)爭(zhēng)性問題。

7. 檢測(cè)分子長(zhǎng)度可以任意設(shè)置，靈活性大。

三、RPA法缺點(diǎn)

?RNA酶保護(hù)試驗(yàn)方法的主要缺點(diǎn)包括RNA探針的制備過程復(fù)雜、核酸酶消化時(shí)酶量的控制困難、需要使用放射性同位素。?

?RNA探針的制備過程復(fù)雜?：該方法的前提是必須首先將研究的基因克隆到一個(gè)載體中，并清楚插入片段的方向。載體插入片段兩側(cè)需要有T3、T7或SP6的啟動(dòng)子位點(diǎn)。載體需要使用合適的內(nèi)切酶線性化，并選擇正確的體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，轉(zhuǎn)錄出要研究的mRNA的互補(bǔ)鏈，再進(jìn)行純化。這一過程相對(duì)繁瑣且技術(shù)要求較高?。

?核酸酶消化時(shí)酶量的控制困難?：在核酸酶消化過程中，酶量的控制是一個(gè)挑戰(zhàn)，因?yàn)槊噶侩y以精確控制，容易導(dǎo)致消化過頭，使得X片上沒有任何顯示。這表明實(shí)驗(yàn)操作對(duì)酶量的控制要求非常高，否則會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性?。

?需要使用放射性同位素?：該方法需要使用放射性同位素進(jìn)行標(biāo)記，雖然這種方法防護(hù)相對(duì)容易，但由于使用了放射性物質(zhì)，需要進(jìn)行特殊的處理和防護(hù)措施。此外，該方法還需要進(jìn)行垂直板狀PAGE，并且涉及到大量的放射性物質(zhì)，如電泳緩沖液、電泳槽、玻璃板、漂洗固定液及托盤等，這些都增加了實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性和安全性考慮。如果非同位素的標(biāo)記和檢測(cè)能夠達(dá)到相同的靈敏度和成本效益，這將是一個(gè)改進(jìn)的方向?。

綜上所述，雖然RNA酶保護(hù)試驗(yàn)方法在定量分析RNA方面具有高靈敏度和高特異性等優(yōu)點(diǎn)，但其操作復(fù)雜、對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求高以及使用放射性同位素的限制是其主要的缺點(diǎn)。

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