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菌種培養(yǎng)
在自然界里，食用菌都不是單獨存在的，而是和許多細菌、放射菌、霉菌等生活在一起的。所謂菌種分離，就是把這些和食用菌一起生活的雜菌分離出來，通過培養(yǎng)，獲得純的優(yōu)良菌種。菌種分母種、原種、栽培種。
(一）母種的分離培養(yǎng) 食用菌母種的分離，可分為孢子分離法、組織分離法以及基內(nèi)菌絲分離等。 1.孢子分離法 孢子分離法，是用食用菌的有性孢子或無性孢子萌發(fā)成菌絲，培養(yǎng)成菌種的方法。這種菌種生活力較強，但孢子個體之間有差異，且自然分化現(xiàn)象較嚴重，變異大，需經(jīng)出菇試驗才能在生產(chǎn)上應(yīng)用。
（l）單孢分離法：是每次或每支試管只取一個擔孢子， 讓它萌發(fā)成菌絲體來獲得純菌種的方法。蘑菇和草菇用單孢分離得到的菌絲，有結(jié)實能力，可采用此法分離生產(chǎn)純菌種。單孢分離生產(chǎn)上較少采用，而且技術(shù)復(fù)雜，一般采用多孢分離法。
（2）多孢分離法：就是把許多孢子接種在同一培養(yǎng)基上，讓它們萌發(fā)、自由交配來獲得食用菌純菌種的一種方法。具體操作方法，有以下幾種： ① 種菇孢子彈射法：選擇個體健壯、朵形圓正，無病蟲害、出菇均勻、高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，適應(yīng)性強的八九分成熟的種菇，切去大部分，菌柄用無菌水沖洗數(shù)遍后再用已滅菌的 紗布或脫脂棉、濾紙吸干表面水分。在接種箱或無菌室內(nèi)，把種菇的菌褶朝下用鐵絲倒掛在玻璃漏斗下面，漏斗倒蓋在培養(yǎng)皿上面；上端小孔用棉花塞住。培養(yǎng)皿放 在一個鋪有紗布的搪瓷盤上，靜置12～20小時，菌褶上的孢子就會散落在培養(yǎng)皿內(nèi)。形成一層粉末狀孢子印（平菇極淡紫色，蘑菇、草菇 為褐色，香菇、金針菇孢子印白色）。用接種針沾取少量孢子在試管中的瓊脂外面或培養(yǎng)皿上劃線接種。待孢子萌發(fā)，生成菌落時，選孢子萌發(fā)早、長勢好的菌落進行試管培養(yǎng)。 還可用孢子采集器收集孢子。方法是選好種菇后，按上述程序，輕輕掀開玻璃鐘罩，將種菇柄朝下插在孢子采收器的鋼絲架上，放在培養(yǎng)皿正中央。隨即蓋好玻璃罩，用紗布將鐘掌周圍塞好。并在紗布上倒少許 HgCl2或無菌水。移入 20℃左右恒溫培養(yǎng)箱。 ②褶上涂抹法：按無菌操作分離時；應(yīng)選擇成熟的種菇，用接種針直接插入褶片之間，輕輕抹取褶片表面子實體尚未彈射的孢子，再在培養(yǎng)基上劃線接種。 ③鉤懸法：取成熟菌蓋的幾片菌褶或一小塊耳片（黑木耳、毛木耳、白木耳〕，用無菌不銹鋼絲（或鐵絲、棉線等其他懸掛材料）懸掛于三角瓶內(nèi)的培養(yǎng)基的上方，勿使接觸到培養(yǎng)基或四周瓶壁。置適宜溫度下培養(yǎng)、轉(zhuǎn)接即可。 ④貼附法：按無菌操作將成熟的菌褶或耳片取一小塊， 用溶化的瓊脂培養(yǎng)基或阿拉伯膠、漿糊等貼附在配管斜面培養(yǎng)基正上方的試管壁上。經(jīng)6～12小時的培養(yǎng)，待孢子落在斜面上，立即把孢子連同部分瓊脂培養(yǎng)基移植到新的試管中培養(yǎng)即可。 孢子分離得到的母種、必須進一步提純復(fù)壯，當母種定植一星期左右，菌絲布滿斜面時，選擇菌絲健壯、生長旺盛無老化、無感染雜茵的母種試管，進而轉(zhuǎn)管擴大，一般到栽培種，轉(zhuǎn)管不宜超過5次。 孢子分離得到的母種，必須通過出菇試驗，鑒定為菌種后，才可供生產(chǎn)使用。 一般菌類如蘑菇、平菇、鳳尾菇、香菇、冬菇和草菇等，都可用多孢分離法獲得母種。 現(xiàn)就銀耳孢子分離略述于下： 按 無菌操作獲取種耳后，懸掛種耳的三角瓶經(jīng)12小時培養(yǎng)后，瓶底培養(yǎng)基表面就有"孢子印"。取出種耳，置 20℃—25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3天，培養(yǎng)基表面會出現(xiàn)乳白色透明的糊狀小菌落，就是銀耳的酵母狀分生孢子形成的少量銀耳菌絲。此時移接入試管斜面培養(yǎng)基上， 待長滿斜面后，再移接入營養(yǎng)豐富，且表面比較干燥的培養(yǎng)基上。經(jīng)30天左右，菌落長出白色菌絲。 銀耳的酵母狀分生孢子、菌絲只有與羽毛狀菌絲的子囊菌（香灰菌絲）混合培養(yǎng)時，由后者幫助分解木材及其他一些纖維物質(zhì)，提供營養(yǎng)，才能利于銀耳孢子萌發(fā)，菌絲的定植和子實體的形成。
在兩種菌絲交會時，先選出兩種純菌絲。 羽毛狀菌絲要純化選育，一般要選取生長迅速，爬壁力強的試管斜面或種瓶，取先端菌絲，轉(zhuǎn)管移接，置25℃—28℃上培養(yǎng)，重復(fù)轉(zhuǎn)管幾次即可得到優(yōu)良純種。 銀耳菌絲的特點，菌絲生長緩慢，擔孢子也不易萌發(fā)。在進行兩菌混合時，先取經(jīng)8～IO天培養(yǎng)的銀耳菌絲斜面，按無菌操作方法在該斜面上距銀耳菌絲約0.5厘米處接入一 小塊羽毛狀菌絲。置25℃下培養(yǎng)1周即得到混合好的銀耳母種。 2．組織分離培養(yǎng)法 利用子實體內(nèi)部組織，進行無性繁殖而獲得母種的簡便方法，即組織分離。該法操作簡便，菌絲生長發(fā)育快，品種特性易保存下來，特別是雜交育種后，優(yōu)良菌株用組織分離法能使遺傳特性穩(wěn)定下來。
常采用以下分離方法。
（l） 子實體分離：種菇要選朵大蓋厚，柄短，八九分成熟的優(yōu)良品種。切去菇兩基部，在無菌箱內(nèi)以0.1％的 HgCl2水浸幾分鐘，再用無菌水沖洗并揩干或用75％酒精 棉球擦拭菌蓋與菌柄2次，進行表面消毒。接種時，只要將種菇撕開，在萌蓋和菌柄交界處或菌褶處，挑取一小塊組織；移接 到PDA培養(yǎng)基上。置25℃左右溫度下培養(yǎng)3-5天，就可以看到組織上產(chǎn)生白色絨毛狀菌絲，轉(zhuǎn)管擴大即得到菌種。如香菇、平菇等可以用此方法。
（2） 菌核分離：茯苓、豬苓、雷丸等菌的子實體不易采集。而常見的是它貯藏營養(yǎng)的菌核。用菌核分離，同樣可以獲得菌種。方法是將菌核表面洗凈，用酒精或 HgCl2消毒 后，切開菌核，取中間組織一小塊，約黃豆大小，接種在PDA 培養(yǎng)基斜面上，保溫培養(yǎng)。應(yīng)注意的是，菌核是貯藏器官，大部分是多糖類物質(zhì)，只含有少量的菌絲，因此挑取的組織塊要大一些，如果組織塊過小，則不易分出菌種。
（3）菌素分離：有一部分子實體不易找到，也沒有菌核，可以用菌素進行分離。如蜜環(huán)菌、假蜜環(huán)菌。其操作方法是先用酒精或 HgCl2將菌素表面黑 色皮層輕輕擦拭2～3次， 然后去掉黑色外皮層（菌鞘），抽出白色菌髓部分；用無菌剪刀將菌髓剪一小段，接種在培養(yǎng)基上，保溫培養(yǎng)，即得該菌菌種。 菌素分離要注意：因菌素比較細小，分離素也比較細小，分離時極易污染雜菌，所以要嚴格操作。 3．基內(nèi)菌絲分離培養(yǎng)法 利用食用菌生育的基質(zhì)作為分離材料，來得到純菌種的一種方法，叫基內(nèi)菌絲分離法。 此種分離方法是適宜只有在特定的季節(jié)才出現(xiàn)，而且是朝生暮死，不易采得的子實體?；鶅?nèi)分離法與組織分離法不同之點是，干燥的菇木或耳木中的菌絲常呈休眠狀 態(tài)。接種后有時并不立刻恢復(fù)生長。因此，有必要保留較長的時間（約1個月），以斷定菌絲是否能成活?；鶅?nèi)菌絲分離法又可分為，材中菌絲分離（即菇木或耳木 分離法）及土中菌絲分離法等。
（1）材中菌絲分離法：就是菇木或耳木分離法，為了減少雜菌的感染，菇（耳）木在分離之前，必須進行無菌處理?？?以把菇（耳）水表面用酒精燈火焰輕輕燒過，以燒死霉菌的孢子，或再用0.1％的 HgCl2水浸孢幾分鐘，然后用無菌水沖洗后用無菌濾紙吸干。接種塊切取時應(yīng)注意。接種塊必須在該菌菌絲分布的范圍內(nèi)切取。所以，菌絲生長緩慢的種類應(yīng)淺?。痪N生長快的種類可以深取。同時。還應(yīng)根據(jù)菇菌的種類、木材質(zhì)地、菇（耳）木粗細、發(fā)育時間的長短來確定菌絲分布的范圍。然后用一把利刀進行切取。接種塊應(yīng)盡量小些，以減少雜菌感染機會，提離菌種的純度。接種塊移到培養(yǎng)基上，就 應(yīng)該放到適合菌絲生長的22℃～26℃ 的溫室或溫箱中培養(yǎng)，使菌絲恢復(fù)生長。
（2）土中菌絲分離：食用菌種類很多，許多土生的食用菌；孢子不易萌發(fā)。組織分離也不易成功，用土中菌絲分離獲得純種的方法，叫土中菌絲分離。 土 中菌絲分離時要注意，由于土中菌絲體的周圍生活著多種多樣的土壤微生物，因此分離時必須盡可能避開這些微生物的干擾，盡可能批取清潔菌絲素的、不帶雜 物的菌絲接種，反復(fù)用無菌水沖洗，在培養(yǎng)基中加入一些抑制細菌 生長的藥物，如40微克／升的鏈霉素或金霉素。如發(fā)現(xiàn)感染細菌，可以把菌落邊緣的菌絲挑出來，接種到木屑培養(yǎng)基中。因細菌沒有分解木質(zhì)素的能力，因此在木屑培養(yǎng)基中不易擴展；只局限于接種處。待菌絲長出感染區(qū)后，就可以再進行擴大提純了。
（3）子實體基部分離：從瓶栽、袋栽或大床栽培的子實體基部分離出新菌絲的方法，叫子實體基部分離，現(xiàn)以袋栽銀耳為例說明：從出耳早、出耳率離、無病蟲害的栽培室中；選擇生活力頑強的幼耳5袋，移到氣候溫和，有散射光的野外場所進行后期培養(yǎng)，以增強菌絲體的生活力。經(jīng)培養(yǎng) 7～10天后，待子實體直徑達4～5厘米時便可取回，作為分離的母體。再從中篩選理想的一朵，用利刀割掉銀耳子實體，放置于 0℃的冰箱或有C6H6O4S的容器中過夜，以便殺死瓶中的害蟲。然后用75％酒精或HgCl2擦洗耳基和袋子外邊的雜質(zhì)，連同接種工具、接種培養(yǎng)基等移進無菌室。經(jīng)滅菌后，用接種刀把袋口上部約15毫米厚的老菌根挖除，并進行培養(yǎng)。待袋口露出白色菌絲時，用接種針挑取一塊半粒米大的白色菌結(jié)體，迅速移入母種試管培養(yǎng)基 的中央，輕輕地脫去接種針， 塞上棉塞。 為了能夠獲得較多的母種，一次接種量要有100—200支試管，以便從中選擇。分離后應(yīng)及時移入22℃—24℃恒溫箱或溫室中培養(yǎng)。由于培養(yǎng)基內(nèi)水分較 多，菌絲恢復(fù)要比耳木分離得快。經(jīng)2-3天后，分離物的邊緣就可看 到白色菌絲。每天要至少觀察兩次，以便提純。觀察、提純方法與耳木分離法擔同。經(jīng)適溫培養(yǎng)10-15天后，當接種塊扭結(jié)團出現(xiàn)紅、黃色水珠時，即可擴大原種。
(二)原種和栽培種的接種培養(yǎng)
母種獲得以后,為了滿足菌種生產(chǎn)的需要。應(yīng)選出優(yōu)良、純度高的母種進一步擴大為原種。 原種培養(yǎng)基一般采用棉籽殼、木屑、草類等培養(yǎng)基。
瓶裝或袋裝的原種培養(yǎng)基滅菌后，可送入滅過菌的接種箱內(nèi)，待瓶中的培養(yǎng)基冷至30℃以下，可按照無菌操作程序進行接種。 菌種瓶（袋）放入培養(yǎng)室時，要經(jīng)常進行檢查，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)雜菌污染，立即取出。培養(yǎng)成的原種，菌絲體必須健壯有力，緊貼瓶壁而不干縮，顏色純正，具有一定清香味，生活力強，擴制成栽培種時吃料快。 栽培種就是將原種進一步擴大培養(yǎng)成三級種，它和原種的接種及培養(yǎng)相同。一般香菇、平菇、冬菇、猴頭、木耳、銀耳的栽培種多用鋸木、棉皮作培養(yǎng)基。蘑菇多用糞草做培養(yǎng)料。 栽培種要求料塊不脫水干縮。菌絲體健壯有力、顏色純正，有清香味，無老化現(xiàn)象，無雜菌污染，有的種許可有少量原基，接入栽培料后，發(fā)菌快，長勢好，生活力強。原種在接栽培種時，原種瓶口的一層菌絲體應(yīng)挖去不用。
（三）液體種的簡單培養(yǎng) 目前，用液體深層發(fā)酵法生產(chǎn)菌種，具有生產(chǎn)量大、周期短、菌齡整齊、成本低廉、接種方便等特點，是實現(xiàn)食用菌工廠化生產(chǎn)的目標?，F(xiàn)將液體種培育過程簡述于后，供參考。 簡言之就是將純正優(yōu)良的菌種，接入液體培養(yǎng)基（固體培養(yǎng)基不加凝固劑），使菌絲繁殖形成大量小菌球，然后將這種培養(yǎng)基拌入木屑或棉籽皮料內(nèi)，制成菌塊、培養(yǎng)其形成子實體。還可用于制原種、栽培種。 培養(yǎng)液體菌種，可將培養(yǎng)液裝入三角瓶中，約占空瓶的五分之一重量。用搖瓶機（也稱搖床）來培養(yǎng)。搖瓶機有旋轉(zhuǎn)式和往復(fù)式兩種，一般多用往復(fù)式。液體培養(yǎng)基可用馬鈴薯汁（加糖），麥芽汁配制，也可用玉米粉、豆餅粉、糖、無機鹽等配制?？梢曰旌吓囵B(yǎng)基，因適用于多種食用菌和藥用菌的培養(yǎng)，均有好效果。組分：豆餅 粉2％， 玉米粉1％， 葡萄糖3％，酵母粉0.5％，磷酸二氫鉀0.1％，碳酸鈣 0.2％， pH自然， 12℃滅菌半小時。然后接種培養(yǎng)。 如果生產(chǎn)量較大，在三角瓶的基礎(chǔ)上，再逐級擴大種子缸，發(fā)酵罐中進行液體深層通氣發(fā)酵，產(chǎn)生大量菌種。但由于生產(chǎn)中要求設(shè)備繁多，技術(shù)性強，我們還應(yīng)創(chuàng)造條件；實現(xiàn)食用菌栽培的現(xiàn)代化。
（四）菌種質(zhì)量的鑒定 菌種質(zhì)量鑒定較為適合的方法是，做出菇試驗。但是時間比較長。在購置菌種時，或在菌種生產(chǎn)中，如何能知菌絲生長情況，快速判斷菌種質(zhì)量？我們介紹幾種方法： 1.肉眼觀察：優(yōu)良菌種菌絲濃白，絨狀，粗壯密集，生長整齊，速度快，香味濃厚。 2.優(yōu)良菌種標準可歸納為："純、香、正、壯、潤"五個字。檢查時，打開瓶塞，從菌種瓶中部取出小塊菌絲體，觀察色澤，聞其氣味，手捏料塊檢查其含水量，看是否符合上述要求標準。 3. 顯微鏡檢查：挑取少量菌絲，置顯微鏡上觀察其形態(tài)，菌絲分枝，分隔情況，鎖狀聯(lián)合，細胞膜的厚薄。 培養(yǎng)觀察：從菌種瓶中挑取小塊菌絲體，接種斜面試管培養(yǎng)基上，置23℃～25℃恒溫中培養(yǎng)，經(jīng)五周后檢查菌種生活力。如果菌絲生長快，旺盛純一，健壯濃 厚，長且整齊，則表示菌種的生活力強。 4.分塊法：在桌上放一張白紙，把菌齡相同的菌種從瓶內(nèi)取出一大塊，用手分成2塊，再把2塊分成4塊，4塊 分成8塊，依次進行。優(yōu)良菌種整塊多，碎渣少。劣次菌整塊少，碎渣多。 5.液體菌種鑒別：當三角瓶或發(fā)酵缸培養(yǎng)3-7天后，如液面出現(xiàn)氣泡，產(chǎn)生"油皮"、混濁等現(xiàn)象，說明菌種本 身帶有雜菌。如菌塊上浮，或遲遲長出很薄的菌絲層，則說明菌種生活力弱。白塊四周的菌絲生長快、濃白、棉絮狀，表明菌種生命力強。
（五）菌種生產(chǎn)過程中的雜茵防治 在 生產(chǎn)菌種時，要時刻注意雜菌污染，以防為主，一旦發(fā)生，*很不容易。所以整個制種過程都必須在無菌條件下進行。接種箱及所有分離、接種的用具、器皿，都 要進行嚴格的消毒滅菌。工作人員的雙手要用消毒劑清洗，并穿戴消過毒的工作服、帽和口罩，動作要敏捷、準確，盡量不要講話走動，以防空氣中的雜菌感染。 分離母種時，選擇出菇早、生活力強，潮菇是關(guān)鍵，因它生活力強，接種后迅速占領(lǐng)陣地，無雜菌侵入的機會。 被污染的菌種，原因是多方面的，一般是滅菌不*所致，或因接種時無菌操作不嚴、瓶蓋不合適造成的。所以滅菌一定要*，建議在接種萌將培養(yǎng)基置25℃左右恒溫箱中做效果檢查，經(jīng)2天不長雜菌，說明*，可以使用，接種過程中一定要嚴格無菌操作。 污染雜菌另一個原因可能是分離母種時感染雜菌，因種菇表面帶菌，消毒不*，通過組織塊將雜菌帶入培養(yǎng)基。 總之，污染機會很多，要注意環(huán)境消毒，按無菌操作規(guī)程*滅菌，層層把關(guān)，環(huán)環(huán)抓緊，嚴加注意；提離菌種質(zhì)量。
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