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細(xì)胞傳代培養(yǎng)的基本原則
生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中常常會(huì)用到細(xì)胞系，因?yàn)樗鼈兛梢钥焖偕L(zhǎng)和擴(kuò)增提供實(shí)驗(yàn)分析要用到的細(xì)胞，而細(xì)胞培養(yǎng)箱恰恰能提供培養(yǎng)所需的環(huán)境。細(xì)胞系與新分離的或原代細(xì)胞的培養(yǎng)條件相類似，但也有一些基本不同的地方：
（1）每個(gè)細(xì)胞系需要其特定的生長(zhǎng)因子混合物。
（2）與原代細(xì)胞相比，它們的生長(zhǎng)需要更嚴(yán)密的監(jiān)測(cè)，因?yàn)槭顾鼈儫o(wú)限生長(zhǎng)的突變同時(shí)也會(huì)造成它們很快達(dá)到過(guò)度生長(zhǎng)。因此，當(dāng)細(xì)胞系生長(zhǎng)到了幾乎覆蓋整個(gè)培養(yǎng)器皿底部，也就是90%的密度時(shí)，細(xì)胞需要重懸洗滌用于實(shí)驗(yàn)或凍存以備將來(lái)使用，或者重新接種到新的培養(yǎng)器皿進(jìn)一步擴(kuò)增。
細(xì)胞傳代或續(xù)代培養(yǎng)是將細(xì)胞從現(xiàn)有的培養(yǎng)物分開(kāi)或分出來(lái)開(kāi)始新的培養(yǎng)，并加入新鮮培養(yǎng)液來(lái)促進(jìn)擴(kuò)增的常用手段。盡管它的概念本身相對(duì)簡(jiǎn)單，本短文中喆圖小編將分享能成功保存和擴(kuò)增細(xì)胞系的一些更重要的步驟。
細(xì)胞傳代的基本原則
代謝的有毒物質(zhì)會(huì)隨時(shí)間在細(xì)胞培養(yǎng)液中累積。當(dāng)擴(kuò)增細(xì)胞時(shí)，尤為重要的是經(jīng)常更換培養(yǎng)液以維持細(xì)胞健康和監(jiān)測(cè)細(xì)胞擴(kuò)增情況以避免細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)度。
傳代的細(xì)胞通常分為三個(gè)主要類型：腫瘤細(xì)胞系、永生化細(xì)胞系、干細(xì)胞系。
永生化細(xì)胞系是那些來(lái)自多細(xì)胞生物的細(xì)胞通過(guò)一些突變修飾改變了細(xì)胞周期調(diào)控從而可以無(wú)限繁殖的細(xì)胞。
與腫瘤永生化的細(xì)胞系相反，干細(xì)胞系通常從成人和胚胎組織的可自我更新的多能細(xì)胞中分離得到。這些細(xì)胞, 如您在短片中看到的人類胚胎干細(xì)胞 , 在適當(dāng)?shù)臈l件下也能無(wú)限傳代培養(yǎng)。
細(xì)胞在優(yōu)化條件下可以懸浮培養(yǎng)，如從血液中分離到的永生化細(xì)胞, 或者貼壁培養(yǎng)，如許多從組織中分離的細(xì)胞系。
貼壁細(xì)胞的生長(zhǎng)必須仔細(xì)監(jiān)測(cè)以確保細(xì)胞保持健康。根據(jù)細(xì)胞類型，很多貼壁細(xì)胞在其達(dá)到70-90%密度，也就是覆蓋了培養(yǎng)容器表面的70-90%時(shí)需要傳代。
要謹(jǐn)記，這些細(xì)胞系雖然保留了原細(xì)胞源的很多特征，但是每次傳代也會(huì)使它們開(kāi)始產(chǎn)生一些擴(kuò)增細(xì)胞的*特性。因此，對(duì)任何一個(gè)特定細(xì)胞系，要考慮限制傳代的次數(shù)。
細(xì)胞傳代常用的儀器和試劑
傳代細(xì)胞時(shí)，使用無(wú)菌技術(shù)和合適的試劑及設(shè)備尤為重要。
針對(duì)您的細(xì)胞系選擇合適的培養(yǎng)液來(lái)得到適宜的生長(zhǎng)和擴(kuò)增很關(guān)鍵。每一個(gè)細(xì)胞系都有特定的生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)組分配方，但是大多數(shù)細(xì)胞系起碼需要的添加物有以下這些：血清，如胎牛血清，需熱處理滅活其胎牛成分，它為細(xì)胞生長(zhǎng)提供重要的生長(zhǎng)因子?？股?，如青霉素和鏈霉素用于防止細(xì)胞污染。其他的生長(zhǎng)因子，如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，有助于延長(zhǎng)細(xì)胞系的生長(zhǎng)和擴(kuò)增。不使用時(shí)，要將這些添加物或者“*”細(xì)胞培養(yǎng)液保存于4攝氏度。
首先要注意細(xì)胞培養(yǎng)液的顏色，富含營(yíng)養(yǎng)的新鮮培養(yǎng)液由于添加了pH指示劑酚紅故為透明橙色。當(dāng)細(xì)胞耗盡培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)成分時(shí)，開(kāi)始在培養(yǎng)物中積累廢物和酸性物質(zhì)，降低pH值。因此，許多細(xì)胞培養(yǎng)液含有酚紅，當(dāng)培養(yǎng)物呈酸性時(shí)會(huì)將培養(yǎng)液顏色由橙色變?yōu)辄S色。培養(yǎng)液需在變黃之前更換。當(dāng)酚紅變?yōu)榉奂t色時(shí)，說(shuō)明培養(yǎng)基pH偏堿，不利于細(xì)胞健康生長(zhǎng)。這時(shí)可能需要改變二氧化碳濃度并更換培養(yǎng)液。
很多貼壁細(xì)胞系可天然附著于無(wú)涂層的塑料上。因此，塑料細(xì)胞培養(yǎng)板如培養(yǎng)皿或六孔板經(jīng)常用于傳代細(xì)胞。塑料的細(xì)胞培養(yǎng)瓶也經(jīng)常用到，如T25的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，常用于擴(kuò)增培養(yǎng)數(shù)目少的細(xì)胞或者開(kāi)始培養(yǎng)生長(zhǎng)緩慢的細(xì)胞系。T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶常用在培養(yǎng)擴(kuò)增速度較快的細(xì)胞系或用于生長(zhǎng)超過(guò)T25培養(yǎng)瓶容量的大量細(xì)胞。
在轉(zhuǎn)移貼壁細(xì)胞時(shí)，要先剪切掉細(xì)胞上與和塑料結(jié)合的蛋白。因此，消化酶胰酶常用于消化細(xì)胞。控制胰酶消化的時(shí)間很重要，因?yàn)槿绻幚頃r(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)損壞細(xì)胞表面的蛋白。細(xì)胞培養(yǎng)液能中和胰酶。所以在胰酶消化前常用磷酸緩沖液或PBS洗滌細(xì)胞。EDTA，一種鈣螯合劑有時(shí)候也用于提高胰酶的蛋白水解功能。
為擴(kuò)增細(xì)胞克隆，將新鮮傳代的細(xì)胞培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，選擇適合該細(xì)胞生長(zhǎng)條件，通常為溫度37度，二氧化碳5％和濕度95%。
如何傳代細(xì)胞
首先，重要的是要清楚細(xì)胞需要監(jiān)測(cè)的頻繁程度，這取決于該細(xì)胞的擴(kuò)增速度。
現(xiàn)在培養(yǎng)液為亮橙色，再觀察其它生長(zhǎng)情況。如培養(yǎng)液是否渾濁-如渾濁則可能有污染, 細(xì)胞的大小和密度以及細(xì)胞的總體質(zhì)量。
如果細(xì)胞密度達(dá)到90%，吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，用無(wú)鈣離子和鎂離子的磷酸緩沖液洗滌。
然后加入胰酶，置于37攝氏度約5分鐘，確認(rèn)細(xì)胞脫壁后，加入新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液終止胰酶的水解。
將懸浮的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到錐形管離心。細(xì)胞離心下來(lái)后，小心棄去上清，重懸細(xì)胞于新鮮培養(yǎng)液。計(jì)數(shù)收集到的細(xì)胞然后根據(jù)合適密度接種細(xì)胞立即進(jìn)行擴(kuò)增或用于將來(lái)擴(kuò)增。
變化和應(yīng)用
現(xiàn)在您知道了如何傳代細(xì)胞，讓我們?cè)賮?lái)看看傳代的一些不同應(yīng)用。
前面已經(jīng)提到，人胚胎干細(xì)胞是一類必須傳代的細(xì)胞。它們通常與小鼠成纖維細(xì)胞MEF共培養(yǎng)，后者能提供幫助干細(xì)胞保持其多能性的因子。
生長(zhǎng)于飼養(yǎng)細(xì)胞上的干細(xì)胞到了合適的發(fā)育階段時(shí)需挑出來(lái)?？捎梦⑿鸵埔汗芴舫龌蛴貌ＡЧぞ咻p輕將其刮下然后接種于新的培養(yǎng)液中進(jìn)行擴(kuò)增。
有一些細(xì)胞系對(duì)酶消化敏感，或者貼壁很緊無(wú)法使用胰酶處理來(lái)重懸。細(xì)胞刮常用來(lái)輕輕將細(xì)胞從培養(yǎng)板的底部刮下來(lái)。如果細(xì)胞貼壁特別緊，可加入培養(yǎng)液或適當(dāng)溶液后用血清吸管用力刮擦。使用該方法時(shí)要小心，細(xì)胞比較脆弱，容易在這種機(jī)械剝離的方法中受損。
為了更快并可重復(fù)性的大量擴(kuò)增細(xì)胞到超過(guò)單層培養(yǎng)瓶容量的規(guī)模，可以使用容量大一些的細(xì)胞培養(yǎng)箱，它的培養(yǎng)量可達(dá)單層培養(yǎng)瓶的30-50倍。
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