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培養(yǎng)人多能干細胞
人多能干細胞(hPSCs)因其擁有分化為機體所有類型細胞的能力，使得hPSCs成為研究發(fā)育機制以及疾病機理MAX常用的工具，同時在再生醫(yī)學以及疾病治療領(lǐng)域也有非常廣泛應(yīng)用。人類多能干細胞因其來源不同又可分為胚胎干細胞（Embryonic stem cell，ESCs）和誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells,iPS cells）。
小鼠胚胎干細胞由Martin Evans在1970年從小鼠胚囊中分離獲得，小鼠胚胎干細胞就可以成功地在體外進行培養(yǎng)。人的胚胎干細胞的體外培養(yǎng)在1998年由美國科學家James Thomson培養(yǎng)成功。
誘導多能干細胞是日本科學家山中伸彌（Shinay Yamanaka）團隊在2006年利用病毒載體將Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc四個轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)入小鼠胚胎成纖維細胞重編程而成。iPS細胞在細胞形態(tài)、基因蛋白表達、表觀遺傳修飾以及畸胎瘤形成能力與胚胎干細胞非常相似。2007年11月，山中伸彌實驗室成功將人皮膚纖維母細胞誘導成iPS細胞。2009年我國科學家周琪院士與曾凡一教授，利用iPS細胞，通過四倍體囊胚注射得到存活并具有繁殖能力的小鼠，世界上證明了iPS細胞的性。
下面對多能干細胞不同培養(yǎng)體系以及傳代方法進行分析：
多能干細胞MAX常見的培養(yǎng)體系有可以分為有血清培養(yǎng)系統(tǒng)跟無血清培養(yǎng)系統(tǒng)：
有血清系統(tǒng)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基配干細胞級血清，同時添加bFGF等生長因子，此方法對血清要求較高，在目前國內(nèi)血清比較亂的情況下，購買的合格的血清是制約細胞培養(yǎng)的主要因素，同時該體系還需要滋養(yǎng)層細胞，培養(yǎng)方法較復雜。
無血清干細胞培養(yǎng)系統(tǒng)發(fā)明大大簡化了干細胞培養(yǎng)流程，目前常用的為Gibco Essential8培養(yǎng)基與Stemcell Technologies 的mTesR系統(tǒng)。兩種系統(tǒng)均為無血清，不需要額外添加生長因子，同時擺脫了滋養(yǎng)層細胞的限制，通過包被培養(yǎng)板就可以達到細胞貼壁的目的。但是，以上兩種培養(yǎng)基價格不菲，同時因為含有牛血清白蛋白（BSA）經(jīng)常會有進口限制。以上產(chǎn)品也均有國內(nèi)替代，Applied Cell分別有人多能干細胞培養(yǎng)基（適用于Essential8 系統(tǒng)），以及Advance 人多能干細胞培養(yǎng)基(適用于mTesR系統(tǒng))。
培養(yǎng)皿包被：目前有兩種常見的包被方法，分別為Matrix基質(zhì)膠包被以及 Vitronectin包被，以上兩種膠對溫度非常敏感，操作要求較高，需要全程低溫操作，同時現(xiàn)配現(xiàn)用。針對以上問題現(xiàn)在多家公司均有有即用型基質(zhì)膠（Gibco,Stemcell Tech,Applied Cell）推出。
傳代：干細胞傳代經(jīng)過多年發(fā)展也逐步簡化，MAX初通過膠原酶消化，挑克隆法傳代；后續(xù)發(fā)展出機械傳代發(fā)，多家公司也推出了細胞切割工具；至目前已經(jīng)可以做到使用消化液完成消化，消化液種類也多種多樣，分別有Accutase,Tryple以及無酶消化液，均可以達到很好的傳代效果。
以下另附多能干細胞培養(yǎng)操作手冊：
人iPS/ES細胞復蘇操作：
人iPS/ES細胞的復蘇標準操作包括實驗前準備工作和實驗過程中的具體操作，下面即人iPS/ES細胞的復蘇標準操作：
1. 實驗前準備工作：
1.1 基質(zhì)膠鋪板、孵育及平衡：取出6孔板/12孔板，每孔內(nèi)加入1 mL/0.5 mL即用型基質(zhì)膠（AC-1001007），輕輕晃動6孔板/12孔板使基質(zhì)膠*覆蓋皿底，然后置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1h~2h，在實驗前拿出并置于超凈工作臺/生物安全柜中室溫下平衡20min或2-8℃靜置過夜備用。如果暫時不用，可用Parafilm封口后2-8℃ 儲存，并于1周內(nèi)使用。
注意：①干細胞復蘇過程中的基質(zhì)膠鋪板數(shù)由凍存細胞密度決定，一支凍存的干細胞的密度在1×106cells/mL左右，需要6孔板鋪1孔或12孔板鋪2孔基質(zhì)膠；②即用型基質(zhì)膠受熱易發(fā)生沉淀，即用即拿及時放回4℃冰箱保存且勿用手直接觸碰基質(zhì)膠液面所及的瓶身，防止生成沉淀，影響基質(zhì)膠質(zhì)量。
1.2 實驗試劑平衡：人多能干細胞培養(yǎng)基（AC-1001000）在實驗前置于室溫中避光平衡30min~1h。
1.3 超凈工作臺/生物安全柜照射紫外：在實驗前打開紫外燈照射30min進行滅菌。
1.4 恒溫水浴鍋準備：水浴鍋溫度設(shè)置在37℃用于hPSC細胞復蘇。
2. 實驗具體操作步驟：
2.1 提前加入人多能干細胞培養(yǎng)基（AC-1001000）：復蘇前，先在15mL離心管中加入2~3mL的干細胞培養(yǎng)基備用。
2.2 解凍：將從液氮中取出的凍存管快速浸入37℃溫水中，快速搖動，使其在1~2min內(nèi)快速解凍；
注意：細胞從液氮中拿出的速度要快，盡量減少其暴露在室溫中的時間。
2.3 離心：凍存管中的凍存液解凍后，將其吸出并緩慢逐滴滴入提前在15mL離心管中加入的干細胞條件培養(yǎng)基中，將15mL離心管置于低速離心機中配比平衡后，1000rpm/min離心3min；
2.4 重懸：離心后棄上清加1mL人多能干細胞培養(yǎng)基（AC-1001000） 對干細胞沉淀進行吹吸混勻，吹吸3~5次左右。
2.5 接種：吹吸均勻后，將已經(jīng)平衡好的即用型基質(zhì)膠（AC-1001007）棄掉，緩慢吹吸15mL離心管中的細胞懸液，緩慢吹吸3~5次，待細胞懸液混勻后，加入到6孔板/12孔板中鋪膠的孔內(nèi)，且補全每孔2 mL/1 mL的培養(yǎng)體系。
2.6 培養(yǎng)：接種后的6孔板/12孔板可以置于倒置相差顯微鏡下觀察接種的干細胞密度以及細胞團塊大小，呈4個細胞以上的團塊較合格，水平十字輕輕晃動6孔板/12孔板使細胞均勻分布。并置于37℃，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第2天觀察細胞貼壁情況；
2.7 換液：從復蘇的時間開始每24h換液一次。
注意：因培養(yǎng)基中活性成分只足夠維持一天，所以每24h應(yīng)及時更換新鮮培養(yǎng)基。
人iPS/ES細胞擴增操作：
人iPS/ES細胞的擴增標準操作包括實驗前準備工作和實驗過程中的具體操作，下面即人iPS/ES細胞的擴增標準操作：
1. 實驗前準備工作：
1.1 基質(zhì)膠鋪板、孵育及平衡：取出6孔板/12孔板，根據(jù)細胞密度決定傳代的孔數(shù)（細胞密度中等則可以按照1:2傳代，密度大則按照1:3或4傳代），并在每孔內(nèi)加入 1 mL/0.5 mL即用型基質(zhì)膠（AC-1001007），輕輕晃動6孔板/12孔板使基質(zhì)膠*覆蓋皿底，然后置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1h~2h，在實驗前拿出并置于超凈工作臺/生物安全柜中室溫下平衡20min或2-8℃靜置過夜備用。如果暫時不用，可用Parafilm封口后2-8℃ 儲存，并于1周內(nèi)使用。
注意：①通常早代次(<10代)的干細胞需要以較低的比例傳代，如1:2-1:3；成功建系的干細胞（10代以上）可以1:4-1:5的比例傳代，傳代的比例由細胞株的生長速率決定。比較理想的傳代時間間隔是3-5天一次，剛剛復蘇的細胞次傳代時間一般是復蘇后第5天。②即用型基質(zhì)膠受熱易發(fā)生沉淀，即用即拿及時放回4℃冰箱保存且勿用手直接觸碰基質(zhì)膠液面所及的瓶身，防止生成沉淀，影響基質(zhì)膠質(zhì)量。
1.2 實驗試劑平衡：人多能干細胞培養(yǎng)基（AC-1001000）、人多能干細胞消化液（AC-1001008 ）以及PBS緩沖液在實驗前置于室溫中避光平衡30min~1h。
1.3 超凈工作臺/生物安全柜照射紫外：在實驗前打開紫外燈照射30min進行滅菌。
2. 實驗具體操作步驟：
2.1 清洗：拿出6孔板/12孔板棄去舊的人多能干細胞培養(yǎng)基（AC-1001000），貼壁緩慢加入1 mL/0.5 mL PBS緩沖液并輕輕晃動，然后沿培養(yǎng)皿邊緣吸去 PBS緩沖液；
2.2 消化：在6孔板/12孔板中加入1 mL/0.5 mL人多能干細胞消化液（AC-1001008）使之覆蓋皿底，并置于CO2培養(yǎng)箱中2~5 min；
注意：消化時間依據(jù)干細胞生長密度，如果密度中等且培養(yǎng)2~3天，消化時間可以控制在2 min~3min，若密度很大且培養(yǎng)4天以上消化時間可以控制在3 min~5min，消化時間快結(jié)束時可以拿到倒置顯微鏡下觀察細胞消化情況，若在顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣以及克隆內(nèi)部細胞間出現(xiàn)間隙，即刻吸掉無酶消化液停止消化。
2.3 吹打：吸掉人多能干細胞消化液（AC-1001008）后，立刻加入平衡好的2mL/1mL干細胞培養(yǎng)基（AC-1001000），用移液槍扇形吹打培養(yǎng)皿底，吹吸次數(shù)保持在3~5次，使皿底貼附的干細胞集落脫落，輕柔緩慢吹吸混勻，制成干細胞懸液，并將其并轉(zhuǎn)移到15mL離心管中；
注意：吹吸皿底細胞的力度要輕柔，吹打脫落和吹吸混勻的次數(shù)在3~5次為宜，盡量避免形成單細胞。如有少量細胞無法從皿底脫落，屬于正?，F(xiàn)象。如有大量細胞無法從皿底脫落，需延長消化時間。
2.4 接種：待皿底的細胞全部吹下并加入到15mL離心管后，將已經(jīng)平衡好的即用型基質(zhì)膠（AC- 1001007）棄掉，緩慢吹吸15mL離心管中的細胞懸液，緩慢吹吸1~2次，待細胞懸液混勻后，加入到6孔板/12孔板中鋪膠的孔內(nèi)，且補全每孔2mL/1mL的培養(yǎng)體系。
2.5 培養(yǎng)：接種后的6孔板/12孔板可以置于倒置相差顯微鏡下觀察接種的干細胞密度以及細胞團塊大小，呈4個細胞以上的團塊較合格，水平十字輕輕晃動6孔板/12孔板使細胞均勻分布。并置于37℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第2天觀察細胞貼壁情況；
2.6 換液：從傳代的時間開始每24h換液一次。
注意：因培養(yǎng)基中活性成分只足夠維持一天，所以每24h應(yīng)及時更換新鮮培養(yǎng)基。
人iPS/ES細胞凍存操作：
人iPS/ES細胞的凍存標準操作包括實驗前準備工作和實驗過程中的具體操作，下面即人iPS/ES細胞的凍存標準操作：
1. 實驗前準備工作：
1.1 實驗試劑平衡： 人多能干細胞培養(yǎng)基（AC-1001000）、人多能干細胞消化液（AC-1001008）以及PBS緩沖液在實驗前置于室溫中避光平衡30min~1h。
1.2 超凈工作臺/生物安全柜照射紫外：在實驗前打開紫外燈照射30min進行滅菌。
2. 實驗具體操作步驟：
2.1 清洗：拿出6孔板/12孔板棄去舊的人多能干細胞培養(yǎng)基（AC-1001000），貼壁緩慢加入2mL/1mL PBS緩沖液并輕輕晃動，然后沿培養(yǎng)皿邊緣吸去 PBS緩沖液；
2.2 消化：在6孔板/12孔板中加入2mL/1mL人多能干細胞消化液（AC-1001008）使之覆蓋皿底，并置于CO2培養(yǎng)箱中 2~5min；
注意：消化時間依據(jù)干細胞生長密度，如果密度中等且培養(yǎng)2~3天，消化時間可以控制在2 min~3min，若密度很大且培養(yǎng)4天以上消化時間可以控制在3 min~5min ，消化時間快結(jié)束時可以拿到倒置顯微鏡下觀察細胞消化情況，若在顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣以及克隆內(nèi)部細胞間出現(xiàn)間隙，即刻吸掉無酶消化液停止消化。
2.3 吹打：吸掉人多能干細胞消化液（AC-1001008）后，立刻加入平衡好的 1~2 mL人多能干細胞培養(yǎng)基（AC-1001000），用移液槍扇形吹打培養(yǎng)皿底，吹吸次數(shù)保持在3~5次，使皿底貼附的干細胞集落脫落，輕柔緩慢吹吸混勻，制成干細胞懸液，并將其并轉(zhuǎn)移到15mL離心管中；
注意：吹吸皿底細胞的力度要輕柔，吹打脫落和吹吸混勻的次數(shù)在3~5次為宜，盡量避免形成單細胞。如有少量細胞無法從皿底脫落，屬于正常現(xiàn)象。如有大量細胞無法從皿底脫落，需延長消化時間。
2.4 離心：待皿底的細胞全部吹下并加入到15mL離心管后，將15mL離心管置于低速離心機中配比平衡后，1000 rpm/min離心3 min；
2.5 重懸：離心后棄上清，加入1 mL Serum-Free干細胞凍存液（AC-1001011/AC- 1001012）對干細胞沉淀進行吹吸混勻，吹吸3~5次后，將其加入到1.8mL凍存管中；
注意：凍存液即用即拿，及時放回4℃冰箱。通常生長狀態(tài)相同且同時消化的細胞統(tǒng)稱為一批細胞。
2.6 記錄：在凍存管上標記凍存細胞種類、時間、操作者及細胞批次。
2.7 -80℃冰箱平衡：凍存管置于-80℃冰箱過夜。
注意：凍存管放置于-80℃冰箱時，要將凍存管直立放置，切忌凍存管斜放或橫放。
2.8 液氮凍存：凍存管置于 -80℃冰箱過夜后，第2天將其置于液氮中進行長期保存。