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實驗方法原理

        細胞凍存及復蘇的基本原則是慢凍快融，實驗證明這樣可以大限度的保存細胞活力。目前細胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質能提高細胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細胞內的水分滲出細胞外，減少細胞內冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。復蘇細胞應采用快速融化的方法，這樣可以保證細胞外結晶在很短的時間內即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內形成胞內再結晶對細胞造成損傷。

實驗材料 細胞 
儀器、耗材 微量加樣槍、吸頭、離心管、凍存管、槍頭膠、塞移液管、玻璃瓶、紅血球計數(shù)板、記號筆、醫(yī)用橡皮、膏移液槍、超凈工作臺、離心機、恒溫水浴箱、冰箱、倒置相差顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、液氮冰箱、

1. 儀器：凈化工作臺、 離心機、恒溫水浴鍋、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、液氮冰箱。

3. 塑料器皿： 吸頭、槍頭、膠塞、移液管（10ml）、15ml離心管、凍存管（1～2ml）。

5. 試劑：D-Hanks液、小牛血清、培養(yǎng)液、雙抗（青霉素、鏈霉素）、胰蛋白酶（0.08%）、1NHCl、7.4%NaHCO3、DMSO（分析純）或無色新鮮甘油。

1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液。

3. 離心1 000 rpm，5 min。

5. 將細胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml。

7. 凍存：標準的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/ min；當溫度達-25℃以下時，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2 h ，然后放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內。

1. 從液氮容器中取出凍存管，直接浸入水浴鍋37℃溫水中，并不時搖動令其盡快融化。

3. 離心， 1 000 rpm，5 min。

5. 次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。收起

 2. 將凍存管放入液氮容器或從中取出時，要做好防護工作，以免凍傷。

其他

二、慢凍程序

2. 簡易程序：將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1~2 ℃的速度，在40 min內降至液氮表面過夜，次晨投人液氮中。

 三、低溫保護劑的應用 在細胞凍存時加入溫保護劑，能大大提高凍存效果。 常用的低溫保護劑是DMSO，它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結過程，能使細胞內水分在凍結前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。

1. 預先配制凍存液 （1）10%DMSO + 細胞生長液（20%血清+基礎培養(yǎng)液） （2）10%甘油+ 細胞生長液（20%血清+基礎培養(yǎng)液）

3. 加入1 ml細胞于凍存管中，密封后標記冷凍細胞名稱和冷凍日期。液氮長期保存。

1. 快速解凍 凍存細胞從液氮中取出后，立即放入3中，輕輕搖動冷凍管，使其在1 分鐘內全部融化（不要超過3 分鐘）。

3. 如果細胞對冷凍保護劑特別敏感 解凍后的細胞應先通過離心去除冷凍保護劑，然后再接種到含*生長培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。

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