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果蠅伴性隱性致死試驗(yàn)
1 范圍
本規(guī)范規(guī)定了果蠅伴性隱性致死試驗(yàn)的基本原則、要求和方法。
本規(guī)范適用于化學(xué)品的遺傳毒性檢測(cè)。
2 規(guī)范性引用文件
OECD Guideline for Testing of Chemicals (No.477, April 1984)
USEPA OPPTS Health Effects Test Guidelines （Series 870.5275, June 1996）
3 試驗(yàn)?zāi)康?br />檢測(cè)化學(xué)品能否引起果蠅生殖細(xì)胞的點(diǎn)突變和小的缺失突變。
4 定義
4.1 致死突變（Lethal Mutation）：是基因組的一種改變，當(dāng)表達(dá)時(shí)引起攜帶者死亡。
4.2 隱性突變（Recessive Mutation）：是在純合子或半合子試驗(yàn)生物中的基因組的一種改變，但只有純合子才表達(dá)相應(yīng)的表現(xiàn)型。
4.3 伴性基因（Sex-linked genes）：基因位于性染色體上，在本方法中指位于X染色體上的基因。
5 試驗(yàn)基本原理
根據(jù)隱性基因在性遺傳中的交叉遺傳特征，即雄蠅的X染色體傳給F1代雌蠅。又通過(guò)F1代傳給F2代雄蠅。位于X染色體上的隱性基因能在半合子雄蠅中表現(xiàn)出來(lái)。據(jù)此推斷致死突變的存在。
據(jù)此，利用眼睛顏色性狀由X染色體上的基因決定，并與X染色體的遺傳相關(guān)聯(lián)的特征來(lái)作為觀察在X染色體上基因突變的標(biāo)記，故以染毒的野生型雄蠅（紅色圓眼，正常蠅），與Basc（Muller-5）雌蠅（淡杏色棒眼，在兩個(gè)X染色體上各帶一個(gè)倒位以防止F1代把處理過(guò)的父系X染色體和母系X染色體互換）交配，如雄蠅經(jīng)受試樣品處理后，在X染色體上的基因發(fā)生隱性致死，則可通過(guò)上述兩點(diǎn)遺傳規(guī)則于F2代的雄蠅中表現(xiàn)出來(lái)，并籍眼睛顏色為標(biāo)記來(lái)判斷試驗(yàn)的結(jié)果。即根據(jù)孟德?tīng)柗诸惪僧a(chǎn)生四種不同表型的F2代，有隱性致死時(shí)在F2代中沒(méi)有紅色圓眼的雄蠅。
6 試驗(yàn)方法
6.1試劑與 儀器
6.1.1 試劑：75%酒精、丙酸
6.1.2 培養(yǎng)基的制備
大小試管和海綿塞洗凈后，分別于120℃ 2h干燥消毒后或曬干后備用。
6.1.2.1 蔗糖26g、瓊脂3g，加水150ml
6.1.2.2 玉米粉 34g、酵母粉4g，加水150ml
6.1.2.3 步驟：按6.1.2.1煮沸后再按6.1.2.2倒入混勻、煮沸，然后加丙酸2ml，攪勻，分裝于指管內(nèi)，每管厚度約1.5～2.0cm，備用。
6.1.3 儀器 和器材
電熱恒熱干燥箱、生化培養(yǎng)箱、立體解剖顯微鏡、放大鏡、空調(diào)機(jī)、麻醉瓶、培養(yǎng)指管（3 cm×10 cm）、試管盤(pán)及架、白瓷板、海綿墊、毛筆、海綿塞。
6.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：果蠅
雄蠅用3～4d齡的野生型黑腹果蠅（Drosophila melarogaster），雌蠅用Basc（Muller-5）品系3～5d齡的處女蠅。飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在25℃±1℃。
6.3 受試樣品配制
受試樣品應(yīng)溶于水中或懸浮于適當(dāng)?shù)馁x形劑（如乙醇、吐溫60或吐溫80）中，然后在給樣前用水或生理鹽水稀釋，避免用二甲基亞砜（DMSO）作為賦形劑。
6.4 劑量設(shè)計(jì)
對(duì)受試樣品突變進(jìn)行初步評(píng)價(jià)時(shí)，測(cè)試一個(gè)最大耐受劑量或者是可能達(dá)到的最高劑量，如果為了測(cè)定劑量-反應(yīng)關(guān)系時(shí)，至少需要設(shè)三個(gè)劑量組。