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整體分子量測(cè)定是蛋白質(zhì)藥物產(chǎn)品（如單 抗）研發(fā)與質(zhì)控中常進(jìn)行的分析項(xiàng)目，而 ESI-Orbitrap MS（電噴霧離子化-靜電場(chǎng)軌道阱 質(zhì)譜）已經(jīng)成為常用的測(cè)量方法之一。而 另一種常見(jiàn)質(zhì)譜技術(shù)MALDI—TOF（基質(zhì)輔助 激光解析-飛行時(shí)間質(zhì)譜）無(wú)法進(jìn)行此項(xiàng)分析， 其原因是由于：在MALDI條件下，蛋白將主要 形成單電荷離子，而目前的TOF型質(zhì)譜 在高質(zhì)荷比范圍分析中（10萬(wàn)m/z以上范圍）， 分辨率也僅有數(shù)千。因此當(dāng)面對(duì)質(zhì)量巨大的 蛋白質(zhì)藥物離子時(shí)（如單抗分子量近15萬(wàn)）， TOF分辨率明顯不足，不但無(wú)法進(jìn)行分子量的 測(cè)定，甚至連單抗的糖型也根本無(wú)法辨 別（圖1）。在ESI（電噴霧離子化）條件下， 蛋白分子將攜帶多電荷，以單抗為例，其將 攜帶40-70 個(gè)左右的電荷，信號(hào)落入2500- 3500m/z 范圍內(nèi) 。 在此質(zhì)荷比區(qū)域內(nèi) ， Orbitrap質(zhì)譜儀分辨率可達(dá)幾萬(wàn)，因此可從容進(jìn)行此 項(xiàng)分析。

實(shí)驗(yàn)時(shí)，蛋白首先在液相色譜 中通過(guò)C4反相色譜柱進(jìn)行脫鹽，然后在電噴霧離子源實(shí)現(xiàn)蛋白離子化，離子化的蛋白進(jìn) 入質(zhì)譜，產(chǎn)生原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)將通過(guò)去 卷積軟件計(jì)算出蛋白質(zhì)的質(zhì)量。與TOF原理完 全不同，Orbitrap采用傅里葉變換進(jìn)行離子質(zhì) 量分析，在低質(zhì)荷比區(qū)域，其分辨率可達(dá)40 萬(wàn)以上，而TOF分辨率僅為數(shù)千。在2000- 4000m/z范圍，兩者分辨率近似，但由于原理 的不同，Orbitrap更易于實(shí)現(xiàn)基線分離——也 就是說(shuō)即使在分辨率一致的情況下，相比TOF， Orbitrap可獲得更為清晰的質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)（圖2） [1-3] 。高質(zhì)量的原始數(shù)據(jù)為分析結(jié)果提供了保 證。在完整單抗分析中，Orbitrap準(zhǔn)確度一般 為10ppm內(nèi)（以單抗分子量15萬(wàn)計(jì)算，10ppm 約相當(dāng)于1.5Da），而TOF為20-30ppm左右。 Orbitrap不僅準(zhǔn)確度高，更由于在硬件中伴有 離子蓄積設(shè)計(jì)，而使靈敏度更高（TOF質(zhì)譜受 到分析原理的局限，不能大量蓄積離子分析， 在一定程度上影響了其靈敏度）。在圖3中， Orbitrap數(shù)據(jù)清晰地顯示出單抗9種不同的糖型 組合，主要峰的質(zhì)量誤差在10ppm之內(nèi)。

圖1：?jiǎn)慰谷肿恿吭假|(zhì)譜圖對(duì)比，左為MALDI-TOF，右為ESI-Orbitrap數(shù)據(jù)。其中在對(duì)高質(zhì) 荷比離子進(jìn)行采集時(shí)，由于靈敏度原因，TOF只能采用離子的線性飛行模式（此模式下分辨率 僅為數(shù)千），而無(wú)法采用分辨率更高的反射飛行模式（分辨率可達(dá)5萬(wàn)）。

在單抗類藥物中，抗體-化學(xué)藥物偶聯(lián)物 （ Antibody-Drug Conjugate, ADC）利用抗體對(duì) 靶細(xì)胞的特異性結(jié)合能力，輸送高細(xì)胞毒性 化學(xué)藥物，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)癌變細(xì)胞的有效殺傷。 目前，經(jīng)FDA已批準(zhǔn)上市的ADC藥物有三種， 分別為MylotargTM、AdcetrisTM，KadcylaTM，分 別治療急性髓系白血病，霍奇金淋巴瘤，以 及HER2陽(yáng)性的轉(zhuǎn)移性乳腺癌。全分子量測(cè)量 技術(shù)也可用于 ADC 藥物的 DAR （ Drug to Antibody Ratio）值分析。圖4為某ADC藥物去 糖基化后，Orbitrap分析結(jié)果，其中偶聯(lián)了不 同數(shù)量化學(xué)藥物的質(zhì)譜信號(hào)清晰明確，有利 于準(zhǔn)確計(jì)算DAR值（圖4中，未標(biāo)示的峰為 Free Linker信號(hào)）。

在Orbitrap平臺(tái)上還具有一項(xiàng)*的分析 方法——Top Down（至上而下）技術(shù)。Top Down是在完整蛋白的狀態(tài)下，直接對(duì)蛋白整 體進(jìn)行碎裂，通過(guò)碎片分析獲得蛋白結(jié)構(gòu)信息（圖5）。在蛋白藥物分析中，可用于電荷 異質(zhì)性分析的快速方法開(kāi)發(fā)，以及肽圖序列 信息驗(yàn)證。

木瓜蛋白酶及還原快速處理后的，分子量約 為2.5萬(wàn)Da的重鏈Fab與輕鏈Fab部分進(jìn)行分子 質(zhì)量測(cè)量時(shí)，原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)可實(shí)現(xiàn)同位素分 辨，因而可進(jìn)行同位素質(zhì)量計(jì)算（在全單抗 分子下，目前各種類型質(zhì)譜數(shù)據(jù)僅可做平均 分子量測(cè)算）。同位素質(zhì)量精度較平均分子 量更為。在圖6中，單抗重鏈Fab與輕鏈 Fab的分析準(zhǔn)確度分別達(dá)到了驚人的2.7ppm與 0.9ppm（以Da計(jì)算，質(zhì)量誤差約在小數(shù)點(diǎn)后 第二位）。如前所述，加之Top Down提供的 豐富的碎片信息，此項(xiàng)技術(shù)被用于可用于電 荷異質(zhì)性分析的快速方法開(kāi)發(fā)，以及肽圖序 列信息快速驗(yàn)證工作[3] 。

基于Orbitrap的全分子量分析工作，可在 數(shù)分鐘內(nèi)完成。但事實(shí)上，這項(xiàng)看似簡(jiǎn)單的 分析工作，卻蘊(yùn)含了對(duì)質(zhì)譜準(zhǔn)確性、分辨率、 靈敏度、穩(wěn)定性的多項(xiàng)挑戰(zhàn)，卻也正好是 Orbitrap強(qiáng)大性能的集中體現(xiàn)。Orbitrap系列質(zhì)譜也正是基于這樣的品質(zhì)，為其使用者提供 了有力的技術(shù)保證。