分秒必爭，賽默飛Orbitrap質譜參與xin冠抗疫研究
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賽默飛世爾，作為抗疫先鋒之一，在背后助力科學家的研究，守護我們的健康 ，讓世界更安全。
由SARS-CoV-2（2型嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒）引起的xin型冠狀病毒肺炎（COVID-2019）具有高傳染性，xin型冠狀病毒肺炎在中國和的迅速傳播引發(fā)了衛(wèi)生緊急情況。ding尖的科學家針對xin冠病毒進行爭分奪秒的研究，利用Orbitrap質譜技術參與分析病毒相關蛋白結構，病毒感染機制等內容，本文將討論Orbitrap高分辨質譜在xin冠病毒感染致病等機制的亮點研究及技術進展。
1. 靶向蛋白定量方法監(jiān)測xin冠病毒蛋白動態(tài)變化
Orbitrap Eclipse高靈敏度平行反應監(jiān)測靶向定量xin冠病毒蛋白
2019年美國質譜年會，賽默飛重磅推出三合一系列的創(chuàng)新之作——Thermo ScientificTM Orbitrap EclipseTM 質譜儀，旨在解決生物學研究中的分析難題，輕松應對蛋白質組學，生物制藥與蛋白質高級結構分析研究中的各項挑戰(zhàn)，推出不久即投入到xin冠病毒研究中。
近，荷蘭鹿特丹伊拉斯馬斯大學研究團隊使用 Orbitrap Eclipse檢測SARS-CoV-2病毒蛋白肽段序列，作為潛在的診斷工具。作者利用easy1200液相和Eclipse質譜使用靶向方法-平行反應監(jiān)測（PRM）追蹤病毒感染Vero細胞后，幾種SARS-CoV-2蛋白的肽段變化。作者研究了SARS-CoV-2蛋白PRM實驗的檢測限，主要是核衣殼蛋白（NCAP），這是豐富的病毒蛋白，因此是比較好的候選測試分子。Orbitrap Eclipse 質譜的PRM結果顯示對該蛋白靈敏度可達到amol級別，大約為0.9pg。粗略計算表明，這種靈敏度水平應足以檢測理論上與約10000個SARS-CoV-2顆粒相對應的蛋白量。且其他SARS-CoV-2蛋白也是PRM靶向方法的良好候選蛋白[1]。
圖. Orbitrap Eclipse靶向PRM監(jiān)測SARS-CoV-2病毒蛋白肽段序列
此外作者還在進行了整體蛋白質組學分析。在60-90分鐘分析時間內，共鑒定出6500種相關蛋白質。這表明蛋白質組學可以用來研究病毒感染宿主細胞的蛋白質組，是未來新興的研究工具。
2. 蛋白質組學研究xin冠病毒感染的調控機制研究
2.1 Orbitrap 高分辨質譜研究病毒宿主相互作用蛋白揭示感染機制
SARS-CoV-2病毒的基因組有29811個核苷酸，可編碼28-29個蛋白質。其中一個蛋白質E 是一種包膜蛋白，是有助于形成病毒油泡的結構蛋白。一旦病毒進入細胞，它還有其他的功能。例如，附著在蛋白質上，有助于打開和關閉我們自己的基因。當E蛋白干擾時，模式可能會改變。VISTARA BIOSCIENCE研究人員近進行一項研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質E與寄主細胞中的溴多胺蛋白結合。Bromodomain 4（BRD4）是BET亞家族蛋白，通過識別乙?；M蛋白提供了一個招募平臺作用，與非組蛋白靶點相關，除與病毒蛋白復合外，還參與NFKB信號轉導、Myc調控。此外，BRD4還與其它bromodomain蛋白存在協(xié)同作用，其中一些還可能執(zhí)行泛素化功能。另有一位作者使用QE HFX質譜描述了BRD4相互作用蛋白的分子表型，使用了經(jīng)BET抑制劑、與BRD4結合的化合物以及可能的其他bromodomain蛋白處理的人類B細胞系蛋白質組。結果發(fā)現(xiàn)，已鑒定的蛋白定位于SARS-CoV-2病毒感染細胞的相互作用重編程途徑和復合物中[2]，如下圖所示。
圖. 蛋白組學分析SARS-CoV-2病毒感染細胞后BRD4相關互作蛋白
2.2. Q Exactive HF質譜非標定量技術監(jiān)控病毒感染細胞實時變化
法國巴黎薩克利大學團隊，通過使用Thermo ScientificTM Orbitrap Q Exactive HFTM質譜進行niao槍法蛋白質組學研究，獲得了 SARS-CoV-2感染的相關信息，確定了病毒顆粒抗原產生的jia條件。技術流程如下圖所示。
作者用SARS-CoV-2感染Vero E6細胞（MOI 0.01和0.001）。然后用LFQ（非標記定量方法）方法在幾天內監(jiān)測感染的實時變化。總共鑒定了3220個Vero細胞蛋白和6個SARS-CoV-2蛋白，以及27388個Vero細胞和94個病毒特異肽段（FDR<1%）。病毒蛋白水平在不同時間點的動態(tài)變化表明，SARS-CoV-2蛋白合成在感染后持續(xù)增加，在感染第3天左右達到大值。為了評估質譜獲得的病毒圖譜在多大程度上反映了病毒的產生，作者通過qPCR在同一時間點測量了SARS-CoV-2 RNA分子，觀察到了極為豐富的病毒蛋白產量的變化[3]，從而證實可以使用基于質譜的LFQ非標定量法監(jiān)測SARS-CoV-2的感染動力學。
圖. Q Exactive HF質譜進行niao槍法蛋白質組學研究SARS-CoV-2感染的相關蛋白
3. Orbitrap高分辨質譜針對xin冠病毒糖蛋白結構研究進展
3.1. Orbitrap Fusion質譜結合冷凍電鏡解析SARS-CoV-2 S糖蛋白多糖結構
來自CCRC的Robert Woods實驗室通過大量實驗生成了 SARS-CoV-2 S糖蛋白上的聚糖三維結構。整個研究基于所報道的S蛋白3D結構和相關的糖組學數(shù)據(jù)[4]，由賽默飛冷凍電鏡Cryo_EM 以及Thermo ScientificTM Orbitrap FusionTM 質譜結合分析。
他們進行了分子動力學模擬，以觀察多糖的微觀異質性對表位暴露的影響。模糊位置為聚糖結構。M9型（綠色），M5型（深黃色），混合型（橙色），復合型（粉色）。
圖. SARS-CoV-2 S糖蛋白聚糖結構和多糖微觀異質性
3.2. Orbitrap Fusion Lumos質譜繪制xin冠病毒SARS-CoV-2 S蛋白糖基化圖譜
xin型冠狀病毒（SARS-CoV-2）中的刺突蛋白（Spike蛋白）是一種高度糖基化的蛋白質，是病毒結合和進入宿主細胞的關鍵調節(jié)因子，也是研發(fā)抗體及相關藥物的關鍵靶點。該蛋白的位點特異性N-糖基化修飾（包含糖基化位點和糖鏈信息）分析對于了解其功能和藥物研發(fā)具有重要意義。四川大學華西醫(yī)院科研團隊針對該蛋白的位點特異性N-糖基化修飾進行深入分析[5]，具體實驗流程如下。
圖. 利用Orbitrap質譜分析xin冠病毒S蛋白N-糖基化流程
通過使用Thermo ScientificTM Orbitrap FusionTM LumosTM質譜技術的整合糖蛋白質組學新方法，繪制了xin冠病毒SARS-CoV-2重組表達蛋白的所有N糖基化修飾位點以及位點特異性的N-糖鏈組成圖譜，如下圖所示。
圖. S糖蛋白位點特異性N糖基化位點修飾譜
4. 蛋白質組結合代謝組研究xin冠病毒感染病人血清生物標志物
多組學方法研究xin冠肺炎輕重癥患者血清中蛋白和代謝生物標志物
西湖大學生命科學學院與合作團隊對xin冠肺炎患者血液中的蛋白質和代謝物分子進行系統(tǒng)檢測，利用多組學方法研究重癥患者血清的多種蛋白和代謝物分子表型，尋找潛在生物標志物，有望為預測輕癥患者向重癥發(fā)展提供導向。
實驗對99例病毒滅活處理的血清樣本進行了安全處理和Orbitrap質譜分析。根據(jù)現(xiàn)行臨床診斷標準，樣本被分為對照（健康）組、普通流感組、xin冠感染輕癥組、xin冠感染重癥組。運用QE HF質譜對血清樣本中的蛋白質和代謝物的相對濃度進行整體分析[6]，揭示重癥患者體內多種分子調控，具體流程如下圖所示。
圖. 蛋白質組學結合代謝組學圍繞xin冠肺炎患者隊列進行分析流程
與對照（健康）組、普通流感組和輕癥組相比，xin冠肺炎重癥患者的樣本中出現(xiàn)了93種*的蛋白表達和204個特征性改變的代謝分子。其中50種蛋白，與患者體內的巨噬細胞、補體系統(tǒng)、血小板脫顆粒有關。研究團隊還發(fā)現(xiàn)，在xin冠病毒感染的重癥患者體內，有100多種氨基酸及100多種脂質均顯著減少。見下圖。
圖. COVID-2019感染后重癥患者體內的巨噬細胞等通路蛋白質和代謝物變化
基于Orbitrap質譜技術和機器學習分析方法，短時間內整合蛋白質組、臨床、生物、代謝組、計算等多學科數(shù)據(jù)篩選出重癥患者特征性的22個蛋白質和7個代謝物，有望可以輔助現(xiàn)有的診斷分析手段，實現(xiàn)更精準、高效的治療。
xin型冠狀病毒肺炎疫情來勢洶洶，牽動著每一個人的心，在這沒有硝煙的抗疫戰(zhàn)場上，白衣天使和醫(yī)學研究者都是勇敢的戰(zhàn)士。賽默飛也在以自己的力量全力支持國內的xin冠病毒科學研究，我們整理了基于Orbitrap超高分辨質譜技術在xin冠病毒相關的亮點研究，謹以此文致敬白衣天使和深耕醫(yī)學研究的學者們，默默付出，勇敢向前。
參考文獻
[1] TARGETED PROTEOMICS FOR THE DETECTION OF SARS-COV-2 PROTEINS, https://www.biorxiv。。ｏｒｇ/content/10.1101/2020.04.23.057810v1
[2] A proteomic model of SARS-COV2 infection by comparing the interactomes of BRD4 with BET-inhibition and SARS-COV2 viral proteins – implications for re-purposing approved drugs or ubiquitin-mediated degradation of select candidates，DOI:10.21203/rs.3.rs-24573/v1
[3] Shotgun proteomics of SARS-CoV-2 infected cells and its application to the optimisation of whole viral particle antigen production for vaccines, https://www.biorxiv。。ｏｒｇ/content/10.1101/2020.04.17.046193v1
[4] 3D Models of glycosylated SARS-CoV-2 spike protein suggest challenges and opportunities for vaccine development, doi: https://doi.org/10.1101/2020.04.07.030445
[5] Site-specific N-glycosylation Characterization of Recombinant SARS-CoV-2 Spike Proteins using High-Resolution Mass Spectrometry, https://doi.org/10.1101/2020.03.28.013276.
[6] Proteomic and Metabolomic Characterization of COVID-2019 Patient Sera, https://www.medrxiv。。ｏｒｇ/content/10.1101/2020.04.07.20054585v1
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