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多維度+深度的生物藥表征：全新一代Exploris 240質(zhì)譜

閱讀：1130 發(fā)布時(shí)間：2020-6-12

多維度+深度的生物藥表征：全新一代Exploris 240質(zhì)譜

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賽默飛在今年質(zhì)譜年會(huì)上重磅推出兩款智能化Exploris系列質(zhì)譜——Orbitrap Exploris™ 120和Orbitrap Exploris™ 240。之前兩期wei信稿已經(jīng)詳細(xì)介紹了其在代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用，本期小編將分享下Orbitrap Exploris 240在生物藥表征中的應(yīng)用，Exploris 240具有高靈敏度、高分辨率和高質(zhì)量精度等特性可確保其采集的數(shù)據(jù)可信可靠，因此在該簡(jiǎn)單、靈活、穩(wěn)定的質(zhì)譜分析平臺(tái)上可實(shí)現(xiàn)生物藥多維度的深度的表征分析。

愛(ài)爾蘭國(guó)家生物工藝研究培訓(xùn)所（NIBRT）是賽默飛的合作者，他們用 Exploris 240對(duì)單抗樣品進(jìn)行了肽圖和二硫鍵的分析；非變性分子量和電荷變異體的分析；以及多維度氧化翻譯后修飾的深度表征分析，具體的應(yīng)用實(shí)例見(jiàn)下文。

應(yīng)用實(shí)例1: IgG2單抗的肽圖和二硫鍵分析

在肽圖分析中一級(jí)氨基酸序列分析可確定抗體序列的正確性，產(chǎn)品相關(guān)關(guān)鍵質(zhì)量屬性的低豐度翻譯后修飾的鑒定和監(jiān)測(cè)可以確保藥物的質(zhì)量、療效和安全，二硫鍵能保持生物藥的穩(wěn)定和確保其功能正常，所以肽圖和二硫鍵分析是生物藥表征*的項(xiàng)目。在Exploris 240質(zhì)譜平臺(tái)對(duì)IgG2單抗Denosumab進(jìn)行肽圖和二硫鍵的常規(guī)表征分析，分析流程如下圖所示。

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在肽圖分析中需要獲得高序列覆蓋率，CDRs區(qū)和關(guān)鍵區(qū)域需要被檢測(cè)到。得益于Exploris 240的高選擇性、高捕獲率和高靈敏度等特性，Denosumab僅用一種酶切的結(jié)果中，輕重鏈蛋白序列覆蓋率即均達(dá)到100%，表明蛋白序列正確。

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高靈敏度使得低豐度翻譯后修飾能輕松被檢測(cè)到，下圖為低豐度的脫酰胺翻譯后修飾，一級(jí)質(zhì)譜提供高質(zhì)量精度的結(jié)果，質(zhì)量偏差小于3 ppm，通過(guò)二級(jí)譜圖中特征碎片b2和b3離子對(duì)脫酰胺修飾位點(diǎn)定位充分確定。

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比較還原和非還原Denosumab樣品來(lái)確定其二硫鍵的連接方式，鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵均鑒定到，一級(jí)質(zhì)量偏差均小于3 ppm。

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小結(jié)：

Orbitrap Exploris 240可以用于生物藥的常規(guī)表征，僅用一種酶切即可實(shí)現(xiàn)抗體輕重鏈100%序列覆蓋，高靈敏度帶來(lái)高可信的低豐度翻譯后修飾的鑒定結(jié)果，高分辨率帶來(lái)超高的質(zhì)量精度鑒定結(jié)果，Biopharma Finder對(duì)復(fù)雜數(shù)據(jù)分析輕松得到可信的鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵鑒定結(jié)果。

應(yīng)用實(shí)例2: 非變性條件下對(duì)IgG1單抗變異體的高靈敏度表征

非變性條件下獲得的蛋白分子量質(zhì)譜圖與變性條件下相比，其電荷價(jià)態(tài)之間能有更大的空間分離和更少的重疊狀態(tài)。通過(guò)液相分離酸性和堿性蛋白異構(gòu)體后質(zhì)譜檢測(cè)蛋白質(zhì)平均質(zhì)量和保留時(shí)間對(duì)單抗電荷變異體（CVA）進(jìn)行鑒定。

Orbitrap Exploris 240非變性質(zhì)譜和CVA分析流程如下圖所示，其中非變性質(zhì)譜使用尺寸排阻色譜(SEC)分離和CVA使用陽(yáng)離子交換色譜(CEX)分離。

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SEC-MS分析曲妥珠單抗稀釋液，上柱量0.05-50.0 μg，在m/z 5000到7000所有數(shù)據(jù)點(diǎn)都能清楚地檢測(cè)到，繪制相對(duì)于上樣量和多個(gè)電荷價(jià)態(tài)歸一化強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢測(cè)限LOD = 0.03μg，定量限LOQ = 0.08μg。從結(jié)果可知，Exploris 240分析低含量的蛋白質(zhì)不影響譜圖質(zhì)量，檢測(cè)低含量的糖基化修飾是可行的。

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CEX-MS CVA分析需要非常高的質(zhì)譜靈敏度，以確保對(duì)低豐度電荷變異體的可靠鑒定。2號(hào)單抗的CEX-MS分析顯示，與未修飾樣品相比，該突變樣品具有豐富的酸性異構(gòu)體，對(duì)應(yīng)的是脫酰氨類的洗脫早于未修飾的成分。在BPC圖中也觀察到其他形式的異構(gòu)體（如：加K和片段化的形式），所有的異構(gòu)體豐度都≤3%。

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小結(jié)：

Orbitrap Exploris 240非變性質(zhì)譜操作簡(jiǎn)單，獲得的數(shù)據(jù)譜圖信噪比高和質(zhì)量精度高。在非變性質(zhì)譜條件下進(jìn)行完整的分子量分析，具有超高的靈敏度，可以對(duì)痕量樣品進(jìn)行可靠的分析。離子交換色譜結(jié)合Exploris 240的可以在有限的樣本量研究中對(duì)單抗的異質(zhì)性進(jìn)行深入的表征和可靠的鑒定。

應(yīng)用實(shí)例3: 在完整蛋白、亞基和肽段水平對(duì)IgG1單抗氧化翻譯后修飾的多維度表征

氧化是生物藥在生產(chǎn)和存貯中發(fā)生的常見(jiàn)的翻譯后修飾之一，甲硫氨酸尤為敏感，氧化修飾作為關(guān)鍵質(zhì)量屬性會(huì)影響到終藥物的安全性和有效性，需要被檢測(cè)和監(jiān)測(cè)。Exploris 240高分辨質(zhì)譜可以鑒定到低豐度的氧化修飾和在肽段水平提供特征的二級(jí)碎片離子進(jìn)行位點(diǎn)鑒定，確保鑒定結(jié)果的可信可靠。

單抗Ipilimumab和golimumab分別從蛋白、亞基和肽段水平進(jìn)行分析以評(píng)估氧化的情況，分析流程如下圖所示。

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完整蛋白水平氧化翻譯后修飾的鑒定：如下圖所示，對(duì)比Ipilimumab對(duì)照品和強(qiáng)制氧化樣品，放大其中一個(gè)52+電荷價(jià)態(tài)質(zhì)譜峰，糖型峰基線分離，信噪比高，3個(gè)糖型的質(zhì)量偏差小于4 ppm，強(qiáng)制氧化的樣品與對(duì)照品相比有約64Da的質(zhì)量差值，表明在完整蛋白水平可能有4個(gè)甲硫氨酸發(fā)生了氧化修飾

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亞基水平氧化翻譯后修飾的鑒定：Ipilimumab用Ides酶解和TCEP還原后得到Fc/2，LC和Fd’亞基，如下圖所示在mAbPac色譜柱上3個(gè)亞基得到非常好的分離。放大28+質(zhì)譜峰可見(jiàn)三組樣品（對(duì)照，50 ppm H2O2和500 ppm H2O2強(qiáng)制氧化樣品）質(zhì)譜峰基線*分離，電荷價(jià)態(tài)可識(shí)別，BioPharma Finder軟件用Sliding window xtract算法對(duì)他們進(jìn)行去卷積，得到各亞基單同位素分子量和檢測(cè)到Fc/2亞基的氧化形式。

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肽段水平氧化翻譯后修飾的鑒定：如下圖所示，檢測(cè)到重鏈胰酶酶切肽段DTLMISR上發(fā)生約+15.9949 Da的質(zhì)量差值，表明強(qiáng)制氧化的樣品甲硫氨酸上發(fā)生氧化修飾。發(fā)生修飾和未發(fā)生修飾的樣品一級(jí)質(zhì)量精度高，質(zhì)量偏差均小于1ppm。二級(jí)譜圖中特征碎片y5和y6離子能確定氧化修飾發(fā)生的位置，以及譜圖中中性丟失64 Da (CH3SOH)碎片離子進(jìn)一步提高結(jié)果的可信度。

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肽圖水平氧化翻譯后修飾的鑒定結(jié)果跟完整蛋白，亞基水平氧化翻譯后修飾結(jié)果相互驗(yàn)證、相互支持。Biopharma Finder軟件自動(dòng)計(jì)算出ipilimumab 和 golimumab氧化修飾比例。在ipilimumab高濃度的雙氧水中甲硫氨酸氧化修飾比例都增加，從4個(gè)甲硫氨酸氧化發(fā)生的比例和氧化速率的不同，可以推測(cè)Fc端更多暴露在單抗的外表面，從而更容易被氧化。

小結(jié)：

Exploris 240質(zhì)譜提供在完整蛋白、亞基和肽段水平上可信的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)單抗的CQAs平臺(tái)，操作簡(jiǎn)單，質(zhì)量準(zhǔn)確性高。在完整的單抗水平上，對(duì)大多數(shù)的糖基化修飾的完整蛋白分子量的質(zhì)量偏差小于4 ppm。通過(guò)與BioPharma Finder 4.0軟件相結(jié)合，使用滑動(dòng)窗口和Xtract去卷積算法能夠快速、可信的對(duì)單抗亞基和低水平內(nèi)源性氧化翻譯后修飾質(zhì)譜數(shù)據(jù)去卷積，得到單同位素峰分子量。肽段鑒定一級(jí)質(zhì)量精度高，一級(jí)質(zhì)量偏差小于1ppm，鑒定結(jié)果可信可靠。

此外，值得一提的是從控制儀器，數(shù)據(jù)采集，數(shù)據(jù)分析和生成報(bào)告都可以在變色龍軟件中進(jìn)行，對(duì)于后續(xù)將Exploris 240用于QC分析提供保證，該平臺(tái)完*全符合法規(guī)的要求。

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結(jié)語(yǔ)

在生物藥發(fā)現(xiàn)、開(kāi)發(fā)、CMC和QC不同階段對(duì)質(zhì)譜需求不同，賽默飛基于orbitrap高分辨質(zhì)譜在生物制藥各個(gè)環(huán)節(jié)都有完整的解決方案。Exploris 240優(yōu)異的性能使得能對(duì)生物藥更加全面和深度的表征，在生物藥的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)中得到更加優(yōu)異的數(shù)據(jù)，同時(shí)還能減少分析時(shí)間，帶給用戶更*的分析性能和體驗(yàn)。

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