ASMS2020 賽默飛線上預(yù)熱講座集錦第三期：蛋白組學(xué)新技術(shù)與熱點(diǎn)
疫情并不能停止分析科學(xué)家們技術(shù)交流與分享，6月1-12日，質(zhì)譜界盛會(huì)—第68屆美國質(zhì)譜年會(huì)，在線上盛大舉行。在此之前，賽默飛舉辦了線上預(yù)熱講座，內(nèi)容涵蓋LC-MS新產(chǎn)品，以及蛋白組學(xué)、生物制藥、代謝組學(xué)等應(yīng)用方向，所有內(nèi)容現(xiàn)在仍可通過注冊(cè)進(jìn)行線上觀看。
上一期，與大家分享了Surequant靶標(biāo)定量新方法，這一期繼續(xù)與大家分享講座中涉及的蛋白組學(xué)新技術(shù)與熱點(diǎn)。
Prosit: 組學(xué)水平的深度學(xué)習(xí)譜圖預(yù)測(cè)
傳統(tǒng)的質(zhì)譜搜索引擎在匹配理論與實(shí)驗(yàn)譜圖（PSM）時(shí)，不考慮離子強(qiáng)度、碎裂能量等實(shí)驗(yàn)信息。而在DIA方法中，二級(jí)譜碎片離子強(qiáng)度以及母離子保留時(shí)間對(duì)匹配準(zhǔn)確性至關(guān)重要。來自德國慕尼黑大學(xué)的科學(xué)家Bernhard Kuster系統(tǒng)介紹了Prosit譜圖預(yù)測(cè)算法。通過對(duì)數(shù)據(jù)庫中高質(zhì)量質(zhì)譜數(shù)據(jù)的學(xué)習(xí)，建立深度學(xué)習(xí)模型可以很好地預(yù)測(cè)二級(jí)譜圖以及保留時(shí)間等信息。
通過深度學(xué)習(xí)對(duì)碎片保留時(shí)間和離子強(qiáng)度進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測(cè)。A, Prosit深度學(xué)習(xí)機(jī)制。B, Prosit用于預(yù)測(cè)碎片離子強(qiáng)度; C, 碰撞能量校準(zhǔn)的碎片強(qiáng)度預(yù)測(cè)與實(shí)際肽段譜圖更接近（點(diǎn)擊查看大圖）
在DDA中用實(shí)驗(yàn)譜圖與預(yù)測(cè)譜圖進(jìn)行匹配打分，也可以大大提高對(duì)target肽段的檢出能力（FDR=1%），據(jù)Küster介紹，F(xiàn)DR會(huì)低10~100倍。作者在多個(gè)實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了Prosit對(duì)多肽二級(jí)譜以及保留時(shí)間的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，并展示這種預(yù)測(cè)能力極大地提高了搜索質(zhì)量，可以使傳統(tǒng)的target-decoy搜庫方法得到非常大的進(jìn)步。
Prosit深度學(xué)習(xí)機(jī)制提升DDA數(shù)據(jù)的解析結(jié)果。A, Prosit強(qiáng)度預(yù)測(cè)提高數(shù)據(jù)庫檢索的可信度；B，Prosit可以在宏蛋白質(zhì)組大數(shù)據(jù)搜索空間中實(shí)現(xiàn)更可靠的鑒定; C，Prosit預(yù)測(cè)也適用于非胰酶酶切肽段尤其是單電荷肽段，提升對(duì)HLA peptide的解析結(jié)果。（點(diǎn)擊查看大圖）
傳統(tǒng)DIA在建立實(shí)驗(yàn)譜庫時(shí)往往要耗費(fèi)大量的質(zhì)譜時(shí)間，也不能涵蓋樣品中所有肽段的譜圖信息。作者希望通過Prosit深度學(xué)習(xí)機(jī)制可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)二級(jí)譜圖及保留時(shí)間，直接用于DIA的建庫，只需要提供理論肽段序列信息就可以構(gòu)建任何物種的譜圖數(shù)據(jù)庫，可用于多個(gè)DIA以及Proteome Discoverer 2.5軟件分析。
Prosit深度學(xué)習(xí)機(jī)制用于DIA分析。A, Prosit可準(zhǔn)確預(yù)測(cè)保留時(shí)間；B，Prosit與多個(gè)DIA分析軟件合作; C，Prosit也將可以在PD2.5軟件檢索流程中使用。（點(diǎn)擊查看大圖）
單細(xì)胞蛋白組學(xué)的“食譜”
01
單細(xì)胞分析的重要性
異質(zhì)性：常規(guī)蛋白組學(xué)一般為基于細(xì)胞群體的研究，這樣的常規(guī)分析不可避免會(huì)將大量細(xì)胞內(nèi)的信息平均化。而在腫瘤研究以及生殖發(fā)育等重要的生物學(xué)過程中都涉及異質(zhì)性。
樣品量受限的樣品：例如具有高活力和轉(zhuǎn)移潛能的CTC細(xì)胞（循環(huán)腫瘤細(xì)胞），外泌體，細(xì)針穿刺和活檢組織切片樣品等。
02
單細(xì)胞分析流程優(yōu)化
單細(xì)胞蛋白組分析中大的難點(diǎn)是樣品量極少。而常規(guī)蛋白組樣品前處理方法僅適用于大量細(xì)胞樣品的處理；使用常規(guī)反應(yīng)體系時(shí)酶解效率低；樣品濃度很低（單細(xì)胞樣品）時(shí)，同樣降低酶解效率。因此，單細(xì)胞蛋白組學(xué)分析中，無法直接使用常規(guī)蛋白組學(xué)的方法，而是需要對(duì)每個(gè)過程進(jìn)行優(yōu)化。該講座中給出了一個(gè)單細(xì)胞蛋白組學(xué)的專屬“食譜”。
其中樣品前處理，色譜分離和質(zhì)譜分析部分的細(xì)節(jié)內(nèi)容可參見“美夢(mèng)成真——單細(xì)胞蛋白組分析的進(jìn)化之路”，在此詳細(xì)討論講座中的單細(xì)胞獲取和如何提高樣品前處理方法易用性。
03
如何獲取單細(xì)胞
Ø 顯微操縱獲取單細(xì)胞
FACS獲取單細(xì)胞需要一定的細(xì)胞起始量，在總細(xì)胞數(shù)不多的情況下，可通過顯微操縱獲取單細(xì)胞[1]。在顯微鏡的輔助下，使用毛細(xì)管直接從細(xì)胞懸浮液中吸取單個(gè)細(xì)胞至nanoPOTS中進(jìn)行后續(xù)操作。
Ø 熒光激活細(xì)胞分選術(shù)FACS
nanoPOTS芯片，與FACS（熒光激活細(xì)胞分選）以及LC-MS聯(lián)用用于單細(xì)胞蛋白組分析[2]。
Ø 激光捕獲顯微切割LCM
結(jié)合nanoPOTS樣品前處理平臺(tái)與LCM（激光捕獲顯微切割）的蛋白組成像[3]。
04
提高樣品前處理方法易用性
除了開發(fā)樣品前處理方法之外，研究人員也希望通過提高前處理方法的易用性，可以將該方法推廣至更多的實(shí)驗(yàn)室。
Ø 適當(dāng)提高反應(yīng)體系，
應(yīng)用商品化的微量移液器
在nanoPOTS的樣品前處理過程中，需要使用自制的移液機(jī)器人吸取幾十 nL級(jí)別的液體，并對(duì)操作人員的實(shí)驗(yàn)技巧有一定的要求。因此，研究人員比較了使用稍大的反應(yīng)體積，例如幾百nL級(jí)別（μPOTS）時(shí)的分析結(jié)果[4]，此時(shí)可使用商品化的一些微量移液器即可完成移液。在少于100個(gè)細(xì)胞的樣品中也能獲得不錯(cuò)的蛋白和肽段鑒定結(jié)果。
Ø 改造較低成本的移液機(jī)器人
可將商品化的低成本移液機(jī)器人改造成可配置微量注射器，可用于nL級(jí)別的移液，并進(jìn)行后續(xù)的樣品前處理。
將單細(xì)胞蛋白分析轉(zhuǎn)變成常規(guī)分析還需要很長(zhǎng)的路要走，TMT多重標(biāo)記、微流控液滴技術(shù)、高靈敏度的納升色譜柱、Orbitrap Exploris 480 及具有實(shí)時(shí)檢索功能的Orbitrap Eclipse儀器以及FAIMS Pro接口勢(shì)必會(huì)加速單細(xì)胞蛋白組的進(jìn)化路程。
后一期中，我們會(huì)繼續(xù)和大家分享線上預(yù)熱講座中生物制藥的精彩內(nèi)容，敬請(qǐng)期待。
參考文獻(xiàn)
[1] Anal. Chem. 2020, 92, 2665−2671
[2] Angew. Chem. Int. Ed., 2018, 57: 12370-12374
[3] Nature Communicaitons, 2020, 11:8
[4] Analytical and Bioanalytical Chemistry volume, 2019, 411: 4587–4596
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