5分鐘拉近你與科學前沿的距離，一起來了解“FAMIN蛋白對嘌呤核苷酸代謝的影響”
由LACC1編碼的FAMIN（Fatty Acid Metabolism-Immunity Nexus）是一種和許多疾病相關(guān)的蛋白，高外顯率突變，如C284R或I254V，可導致幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎（JIA），成人Still綜合癥，麻風病或早發(fā)炎癥性腸病等。小鼠的基因敲除實驗結(jié)果也顯示FAMIN活性降低會加重敗血癥和關(guān)節(jié)炎的程度，另有研究顯示FAMIN會對線粒體功能的正常發(fā)揮和巨噬細胞的氧化磷酸化及糖酵解都產(chǎn)生影響。
英國阿登布魯克醫(yī)院和劍橋大學在相關(guān)方面做了一個多組學結(jié)合的實驗并將結(jié)果總結(jié)發(fā)表在Cell雜志上，旨在研究FAMIN作為一個多功能嘌呤核苷酸代謝酶的作用，實驗從不同角度，利用不同平臺研究了嘌呤核苷酸的代謝及其對線粒體功能的影響。
圖：嘌呤核苷酸代謝通路
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現(xiàn)就代謝組學的部分進行詳細介紹：
首先 …
將HepG2細胞進行FAMIN siRNA轉(zhuǎn)染，并對細胞數(shù)目和耗氧量等指標進行監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)在FAMINyi制后，細胞增殖減少，糖酵解和氧化磷酸化的速度都有不同程度的下降。將FAMINyi制的 HepG2細胞分別和10ug重組人FAMIN254I或等量蛋白緩沖液（空白對照）在37℃的PBS中孵育1hr，將樣本中的小分子代謝物用甲醇提取并進行LCMS分析，得到超過25,000個特征峰。
圖：正離子和負離子模式下檢測到的離子m/z和豐度
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LCMS實驗在Vanquish+Q Exactive Plus液質(zhì)聯(lián)用平臺上進行，對于極性較高的水相代謝物，采用HILIC色譜柱進行液相分離，Orbitrap質(zhì)譜的分辨率設(shè)置為70,000，wan美分辨復雜的體系，同時高質(zhì)量精度的數(shù)據(jù)確保在化學式匹配和化合物檢索的時候得到準確結(jié)果，zui大程度上減少了假陽性或假陰性情況的發(fā)生。
對比FAMIN254I孵育的樣本和空白對照，發(fā)現(xiàn)FAMIN254I孵育的提取物中3個特征峰有明顯降低，4個升高，就像下面這張火山圖展示的一樣。
確定這7個生物標志物的步驟如下：
在鑒定的過程中，首先需要確定生物標志物的化學式，對于Orbitrap的數(shù)據(jù)來講，這一步是通過精確質(zhì)荷比和同位素精細結(jié)構(gòu)結(jié)合來完成的（質(zhì)量偏差不超過2ppm）；
然后將化學式同二級質(zhì)譜信息結(jié)合，進行數(shù)據(jù)庫的檢索，得到化合物的結(jié)構(gòu)信息，下圖以adenosine為例，上半部分是實測數(shù)據(jù)中的二級質(zhì)譜圖，下半部分是mzCloud數(shù)據(jù)庫里的信息，二者以鏡像圖的形式展示，清楚地體現(xiàn)了實測數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)庫信息的匹配程度，并將匹配到的碎片結(jié)構(gòu)進行標注。
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此處檢索的數(shù)據(jù)庫為mzCloud（https://www.mzcloud。。ｏｒｇ/），mzCloud是規(guī)模龐大、信息豐富的高分辨譜圖庫，現(xiàn)包含超過18,500個化合物，并且這個數(shù)量還在不停增加，譜圖的數(shù)量超過725萬張，包括不同碎裂方式和碰撞能的信息，所有譜圖全部為標準品的實測數(shù)據(jù)，是化合物鑒定的重要支持。
圖：mzCloud界面展示
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對于如此龐大的特征峰數(shù)量和理化性質(zhì)各異的代謝物，實驗者手動鑒定豈不是要做到頭禿，不要擔心，有強大的軟件幫助我們自動進行數(shù)據(jù)處理。這個軟件就是高分辨液質(zhì)數(shù)據(jù)處理的利器——Compound Discoverer。
Compound Discoverer …
Compound Discoverer軟件可以完成從原始數(shù)據(jù)到zui終結(jié)果的全流程工作，包括特征峰提取和對齊、化學式預(yù)測、化合物結(jié)構(gòu)鑒定、代謝通路分析，以及代謝組學常用的主成分分析（PCA）、偏小二乘方判別分析（PLS-DA）等，結(jié)果的呈現(xiàn)形式包括散點圖、火山圖、柱狀圖、箱式圖、熱圖等，如果這些還不能滿足你，別擔心，用戶還可以自編程將數(shù)據(jù)按照自己想要的方式展示或計算。
圖：Compound Discoverer結(jié)果展示示例（左→右：PCA散點圖、火山圖，S-plot，熱圖）
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本研究通過Compound Discoverer軟件的自動峰提取、對齊和鑒定，得到差異代謝物a-c分別是adenosine、inosine和guanosine，為了進一步驗證鑒定結(jié)果的準確性，將樣本中三個化合物的提取離子流圖同標準品進行比對，得到*一致的色譜保留行為，故確定幾個化合物鑒定的準確度，下圖展示了化合物a和b 分別同adenosine和inosine標準品數(shù)據(jù)匹配的情況。
同樣的過程，對含量相對升高的化合物d-g進行鑒定，得到結(jié)果分別為hypoxanthine，guanine，pentose-phosphate, xanthine。至于究竟是哪種pentose-phosphate，同樣采用同標準品的色譜峰比對的方法，并且采用TSQ Quantiva的SRM碎片比例來驗證，確定結(jié)果為R1P，如下圖。
差異代謝物a-c在兩組的峰面積在FAMIN254I組中有所降低，提示FAMIN可以分解胞內(nèi)嘌呤核苷。
同時，化合物d-f在FAMIN254I存在的情況下含量有所升高（g的量太低，不做展示），提示FAMIN在幫助核堿基和R1P合成。
化合物a-c均隨重組FAMIN254I的劑量增加而峰面積降低，而其它核苷酸或核苷并未受FAMIN254I影響，提示FAMIN是作用于嘌呤核苷，將其生成對應(yīng)的核堿基和R1P的酶。
在擬靶向代謝組學的工作中，三重四極桿和Orbitrap高分辨質(zhì)譜相結(jié)合，可以提供豐富的數(shù)據(jù)覆蓋廣度和超高的定量能力，本研究中采用TSQ Quantiva和Q Exactive Plus相結(jié)合，定位到同F(xiàn)AMIN作用相關(guān)的代謝物及其通路。在今年的ASMS，賽默飛推出了新一代Orbitrap Exploris 240，自帶多種方法模板，同TSQ平臺輕松進行方法無縫轉(zhuǎn)換，操作簡便，結(jié)合AcquireX功能，助力擬靶向代謝組學實驗，將研究的覆蓋廣度和數(shù)據(jù)挖掘深度做到j(luò)i致，有興趣的老師請掃描以下二維碼獲得電子樣本。
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