前言 ：寡核苷酸是一類短鏈核苷酸的總稱（包括脫氧核糖核酸及核糖核 酸），如用于基因擴增和基因診斷的 PCR 引物和反義核酸，介導(dǎo) 基因沉默的小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）等，努力 研究開發(fā)基因靶向治療藥物用于治療病毒、腫瘤和遺傳疾病。天然 的寡核苷酸在體內(nèi)容易降解，穩(wěn)定性差。通過修飾的寡核苷酸具有 較好的藥學(xué)特性和體內(nèi)穩(wěn)定性 [1-2]，但合成的寡核苷酸產(chǎn)物含有各 種雜質(zhì)，需純化精制，產(chǎn)物的鑒定和產(chǎn)品的質(zhì)量控制至關(guān)重要。 液相和液質(zhì)聯(lián)用于寡核苷酸目標產(chǎn)物的高分辨分離和鑒定， 可以 判斷待測寡核苷酸結(jié)構(gòu)的變化，比如脫嘌呤、氧化、磷酸化等。寡 核苷酸樣品中存在的鹽分會影響其離子化過程和造成峰強度降低， 因此有必要進行質(zhì)譜鑒定前的除鹽處理。常規(guī)離線除鹽方法耗時； 可以利用在線除鹽方式進行寡核苷酸的分離鑒定，但樣品通量需要 提高，以滿足高通量的要求，如平均每天 2000 個樣品的需求等。
本工作中，我們利用閥切換技術(shù) [3-5] 對寡核苷酸樣品進行在線 除鹽，建立簡單、快速、高效的超高效液相色譜線性離子阱 質(zhì)譜儀（Vanquish Duo-LTQ XL）在線除鹽和寡核苷酸分子量 測定的分析方法。
實驗方法 1. 儀器和耗材 • 包括下列模塊和組件的 Thermo Vanquish Duo 超高效液相色譜系統(tǒng) 泵：Dual Pump（P/N VF-P32-A）自動進樣器：Split Sampler FT（P/N VF-A10-A） 柱溫箱：Column Compartment H（VH-C10-A） • 質(zhì)譜儀：Thermo ScienticTM LTQ-XL 質(zhì)譜 • 分流器：Analytical Scientic Instruments（Model No.600- PO10-06） • 色譜柱：Acclaim Polar Advantage II 2. 試劑 甲醇（質(zhì)譜級，F(xiàn)isher公司）、三乙胺（Sigma）、六氟異丙醇（Sigma）， 去離子水（18.2M?） 3. 樣品 合成的不同分子量的寡核苷酸含鹽的樣品來源于客戶。 4. 色譜條件和質(zhì)譜條件 色譜柱：Acclaim Polar Advantage II（C18-2×10 mm 5 μm） 柱溫：30℃
Vanquish Duo 右泵（平衡泵）流動相 A：0.75% 六氟異丙醇和 0.038% 的三乙胺的水溶液 Vanquish Duo 左泵（分析泵）流動相 B：0.75% 六氟異丙醇和 0.038% 的三乙胺和 90% 甲醇溶液
實驗結(jié)果與討論 1. 色譜柱串聯(lián)在線除鹽 [6] 利用圖 1 的串聯(lián)配置可以加速脫鹽和洗脫過程。在線除鹽和分析的 整個過程主要分為兩個部分：（1）樣品上樣至脫鹽柱 1，在流速 2mL/min 的除鹽水相條件下，樣品中的鹽快速被除去，待測樣品保 留在脫鹽柱上；（2）進行閥切換，洗脫有機相快速進入脫鹽柱 1， 將待測樣品從脫鹽柱 1 上洗脫進入質(zhì)譜檢測。 2. Vanquish Duo 串聯(lián) MS（LTQ XL）進行寡核苷酸定性分析 圖 3-5 所 示， 為 寡 核 苷 酸 樣 品 S1 和 S2 的質(zhì)譜總離子流譜 圖，響應(yīng)良好，測得質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)須保存為 Prole 格式，通過 BioPharmaFinder 軟件 Intact 分析進行去卷積分析，得到相應(yīng)的寡 聚核苷酸樣品分子量（圖 6-8）和去卷積后匹配原始譜圖（圖 9-11）
結(jié)論：本文建立了簡單、快速、高效的液相色譜 - 線性離子阱質(zhì)譜儀 （Vanquish Duo-LTQ XL）在線除鹽和檢測寡核苷酸分子量的分析 方法。該方法一個樣品的整個分析周期為 42 秒（包括進樣針清洗、 進樣和質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集），利用該方法對不同分子量的寡核苷酸樣品 進行快速除鹽分析，測定分子量與理論分子量平均偏差約 100 ppm （表 4）。建立的在線除鹽方法快速簡便，質(zhì)譜鑒定準確度高，樣 品分析周期非常短（42 秒），24h 內(nèi)可以分析高達 2000 個樣品， 滿足寡核苷酸樣品的高通量分析要求。
參考文獻 1. 賈巧云、鄧新秀、高嬋等 . 反相離子對高效液相色譜法分析硫代反義寡 核苷酸 CT102 相關(guān)雜質(zhì)。藥物分析雜質(zhì) 2013,33（7）：1157-1162 2. Martin Gilar.,et al.Characterization of therapeutic oligonucleotides using liquid chromatography with on-line mass spectrometry detection[J].Oligo mucleotides,2003,13:229-243 3. 1. Opiteck G J, Lewis K C, Jorgenson J W, et al. Comprehensive on-line LC/LC/MS of proteins[J]. Analytical Chemistry, 1997, 69(8):1518-1524. 4. 2.Wei J, Sun J, Yu W, et al. Global Proteome Discovery Using an Online Three-Dimensional LC−MS/MS[J]. Journal of Proteome Research, 2005, 4(4):801-808. 5. 3.Yoshida H, Mizukoshi T, Hirayama K, et al. On-line desalting-mass spectrometry system for the structural determination of hydrophilic metabolites, using a column switching technique and a volatile ion-pairing reagent.[J]. Journal of Chromatography A, 2006, 1119(1):315-321. 6. on-line high-throughput desalting to prepare samples for mass spectrometry.application update 174
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