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1.前言 隨著治療性生物產(chǎn)品在藥物市場所占份額的不斷提高，各 國監(jiān)管機(jī)構(gòu)通過發(fā)布質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（Quality by Design, QbD） 原則等手段，對(duì)生物藥的質(zhì)量控制提出了更高的要求。對(duì)于生 物制藥企業(yè)而言，在生產(chǎn)及批次放行過程中對(duì)關(guān)鍵質(zhì)量屬性 （critical quality attribute, CQA）和雜質(zhì)等進(jìn)行鑒定、定量和監(jiān) 控就顯得尤為重要。傳統(tǒng)的質(zhì)控手段包括多種分離手段，如反 相色譜（reversed-phase high performance liquid chromatography, RP-HPLC)、體積排阻色譜（size-exclusion chromatography, SEC）、離子交換色譜（ion-exchange chromatography, IEX）和毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis, CE）等。 2015年，Rogers等基于Orbitrap高分辨質(zhì)譜平臺(tái)發(fā)展了MultiAttribute Method（MAM），用于在一針進(jìn)樣中同時(shí)對(duì)CQA進(jìn)行 鑒定、定量和實(shí)時(shí)監(jiān)控[1]。自從MAM發(fā)布以來，獲得了業(yè)界的 關(guān)注，在近年的學(xué)術(shù)會(huì)議中屢屢成為熱點(diǎn)議題[2]。

在本文中，我們使用Thermo Scientic™ Q Exactive™ Plus Orbitrap™ 高分辨質(zhì)譜平臺(tái)，串聯(lián)Thermo Scientic™ Vanquish™ Flex UHPLC系統(tǒng)，使用Thermo Scientic™ Chromeleon™ 7.2.9 Chromatography Data System (CDS) 與Thermo Scientic™ BioPharma Finder™ 3.2 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和處理(Figure 1).

Figure 1. Thermo Scientic HR MAM 工作流程圖. 使用BioPharma Finder 軟件對(duì)肽圖分析的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，與發(fā)現(xiàn)階段進(jìn)行對(duì)比以鑒定CQAs； 隨后將BioPharma Finder生成的CQA列表導(dǎo)出至變色龍CDS中進(jìn)行常規(guī) GMP階段符合合規(guī)要求的目標(biāo)組分檢測。

 2. 實(shí)驗(yàn)方法

a. 儀器及試劑 • Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer • Vanquish Flex UHPLC system • Thermo Scientic™ Accucore™ Vanquish™ C18+ UHPLC column, 1.5 μm, 2.1 × 150 mm • Thermo Scientic™ Acetonitrile, UHPLC-MS grade • Thermo Scientic™ Pierce™ Trypsin Protease MS grade • Thermo Scientic™ Pierce™ Formic Acid, LC-MS grade • Invitrogen™ UltraPure™ 1 M Tris-HCl Buffer, pH 7.5 • 8.0 M Guanidine Hydrochloride Solution • Bio-Spin P-6 Gel Columns, Tris Buffer • Thermo Scientic™ Zeba Spin Desalting Columns, 0.5mL • Sodium Iodoacetate (IAC) BioUltra >98% purity • DL-Dithiothreitol (DTT) BioXtra ≥99% purity

b. 實(shí)驗(yàn)樣品 NISTmAb Humanized IgG1κ Monoclonal Antibody (NIST, RM 8671)。

c. 樣品前處理步驟 • 商業(yè)化NIST mAb標(biāo)準(zhǔn)品以溶液形式提供，溶于 12.5 mM Lhistidine + 12.5 mM L-histidine HCl (pH 6.0)體系中，濃度為 10.004 ± 0.08 mg/mL。取兩份10 μL NIST mAb標(biāo)準(zhǔn)品，分 別標(biāo)記為RA2和RA3，各加入90 μL Solution I(7 M GuanidineHCl, 100 mM Tris, pH 8.3)，將其濃度調(diào)整為1mg/mL。 • 還原：向上述樣品中分別加入2.0 μL Solution II (500 mM DTT) ，使DTT終濃度為10 mM，隨后室溫孵育30分鐘。 • 烷基化：還原結(jié)束后，向上述樣品中分別加入4.0 μL of Solution III(500 mM IAC)并用移液器充分混合，使IAC終濃度為20 mM，避光室溫孵育20分鐘。 • 溶液置換：烷基化結(jié)束后，向上述樣品中分別加入4.0 μL Solution IV (50 mM DTT)用于中和過量的IAC。隨后分別取 BioSpin-6 column和Thermo Scientic™ Zeba Spin Desalting Columns, 0.5mL各一支，按照其說明書分別將其溶液體系置 換為50 mM Tris（pH 7.9）。棄去下層溶液并更換新的1.5mL 外管，隨后向BioSpin-6 column中加入經(jīng)還原烷基化之后的 RA2樣品，向Zeba Spin Desalting Column中加入經(jīng)還原烷基 化之后的RA3樣品，1000×g轉(zhuǎn)速離心四分鐘后分別收集下層 溶液準(zhǔn)備酶解。 • 酶解：使用雙蒸水將Pierce Trypsin復(fù)溶為1mg/mL,溫和渦旋混 勻。按照酶：蛋白=1:10（w:w）的比例將胰酶溶液分別添加 至前述兩份NIST mAb樣品中，37 °C孵育30分鐘，加入甲酸 （終濃度為10%）終止酶解反應(yīng)，隨后將兩份樣品分別轉(zhuǎn)移 至樣品瓶中并置于液相自動(dòng)進(jìn)樣器里，待后續(xù)分析。

 d. 實(shí)驗(yàn)方法設(shè)置 • 液相色譜：Vanquish Flex UHPLC system • 色譜柱：Accucore Vanquish C18+ UHPLC column (1.5 μm,2.1 × 150 mm) • 柱溫：50 °C（column oven Mode set to Still Air） • 自動(dòng)進(jìn)樣器溫度：5°C • 上樣量：每個(gè)樣品4 μL(約4μg酶解肽段) • 流動(dòng)相： 0.1% formic acid in water (A1) / 0.1% formic acid in acetonitrile (B1) • 流速：0.250 mL/min. 

質(zhì)譜條件如表2所示。其中用于肽圖分析的數(shù)據(jù)使用Top5 ddMS2 方法采集，BioPharma Finder 處理；CQA定量的數(shù)據(jù)使 用Full Scan MS only 方法采集，變色龍軟件處理。

 Table 2. 質(zhì)譜條件. e.數(shù)據(jù)處理軟件 使用Thermo Scientic BioPharma Finder 3.2軟件進(jìn)行肽圖分 析，參數(shù)設(shè)置如表3所示。對(duì)兩份樣品的MS/MS數(shù)據(jù)進(jìn)行搜 庫，以確定用于監(jiān)控和定量的CQA。

參考之前的報(bào)道，在本文的研究中我們選定了如下的CQAs用于 定量：糖基化（glycosylation）、脫酰胺（deamidation）、天 冬氨酸異構(gòu)化（isomerization）和C端賴氨酸丟失（C-terminal lysine truncation）。對(duì)于每個(gè)CQA，我們選取了鑒定到的每個(gè) 電荷態(tài)的前四個(gè)同位素峰，在BioPharma Finder中另存為Target Peptide Workbook，并一鍵導(dǎo)出為BioPharma Finder workbook le (.wbpf)，隨后將其導(dǎo)入變色龍 Processing Method中的 MS Component Table。 任何新發(fā)現(xiàn)的CQA可以隨時(shí)添加進(jìn)BioPharma Finder workbook 和變色龍方法中，這為方法開發(fā)和優(yōu)化階段提供了靈活 性。一旦在變色龍軟件中建立了標(biāo)準(zhǔn)化的分析方法，即可將該 方法應(yīng)用于GMP環(huán)境下的應(yīng)用中。 接下來，使用Chromeleon CDS 7.2.9軟件進(jìn)行CQA定量。我們 基于變色龍軟件中的MS Quantitative模板創(chuàng)建了MAM數(shù)據(jù)處理 的方法，基本參數(shù)如表4所示。在變色龍軟件中，可以對(duì)峰積分 的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以確保積分結(jié)果一致且可信，從而得到準(zhǔn)確 的定量結(jié)果。

 3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果 本次實(shí)驗(yàn)選取的兩份NIST mAb標(biāo)準(zhǔn)品來源于同一批次，通過 對(duì)比不同溶液置換耗材處理后選定CQA含量的變化趨勢，進(jìn)而 研究不同耗材對(duì)CQA定量結(jié)果的影響。圖2展示了Biopharma Finder對(duì)兩個(gè)樣品進(jìn)行肽圖分析的結(jié)果，可見在上樣量約4μg肽 段的情況下，NIST mAb標(biāo)準(zhǔn)品輕鏈覆蓋度≥96%，重鏈覆蓋度 ≥98%，除了一些胰酶酶切過短的肽段沒有鑒定到，其余區(qū)域均 可鑒定到肽段信息，為CQA的選取和定量提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 Figure 2. 兩份NIST mAb標(biāo)準(zhǔn)品（RA2, 上；RA3, 下）酶解肽段基峰譜 圖（Base Peak Chromatogram）. 對(duì)于兩個(gè)樣品，我們分別進(jìn)行了三針技術(shù)重復(fù)。表5展示了對(duì)主 要糖型的定量結(jié)果。由圖中可以看出，分別使用不同前處理耗 材的兩個(gè)樣品的六針進(jìn)樣之間均呈現(xiàn)良好的重現(xiàn)性。

圖3A展示了肽段FNWYVDGVEVHNAK上D283的異構(gòu)化比率和 N289的脫酰胺比率。由圖中不難發(fā)現(xiàn)，兩種不同溶液置換條件 下天冬氨酸異構(gòu)化和脫酰胺化比率并沒有顯著差異，表明對(duì)于這 兩種修飾，使用不同溶液置換耗材也無顯著差異。 以RA2樣品為例，進(jìn)一步觀察發(fā)生天冬氨酸異構(gòu)化和未修飾峰的 對(duì)比，可見由于修飾/未修飾肽段色譜保留時(shí)間的差異，可以將 其分離開，在變色龍軟件中按照保留時(shí)間差異進(jìn)行相應(yīng)設(shè)置，分 別提峰進(jìn)行相對(duì)定量(圖3B)；得益于Orbitrap質(zhì)譜的高靈敏度，相 對(duì)含量只有未修飾峰約0.15%的異構(gòu)化峰也可以檢測到高質(zhì)量的 一級(jí)質(zhì)譜圖和準(zhǔn)確的肽段同位素峰分布(圖3C-F)。

 4.結(jié)論：在本實(shí)驗(yàn)中，我們使用基于Thermo高分辨質(zhì)譜平臺(tái)的HR-MAM 流程對(duì)在前處理步驟中使用不同溶液置換耗材的NIST mAb標(biāo)準(zhǔn) 品進(jìn)行了CQA的鑒定和定量。得益于HR-MAM流程的穩(wěn)健性、 靈活性、特異性和高靈敏度，我們可以在一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)對(duì)多個(gè) CQA進(jìn)行監(jiān)控和定量。 對(duì)比不同溶劑交換前處理耗材的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可發(fā)現(xiàn)肽圖強(qiáng)度、色 譜峰型及分離與肽圖覆蓋度等無明顯差異，且與關(guān)鍵質(zhì)量屬性相 關(guān)的特定修飾，使用不同耗材處理得到的定量比率并無顯著區(qū) 別，更進(jìn)一步證明了HR-MAM流程的穩(wěn)定性。