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關(guān)鍵詞 全自動(dòng) SRM 離子對(duì)優(yōu)化軟件（AutoSRM）；生物標(biāo)記物；食 品；代謝組學(xué)；MRM；營(yíng)養(yǎng)學(xué)；大米

前言 代謝組學(xué)是一門應(yīng)用高通量測(cè)試平臺(tái)研究生物代謝過程中的小 分子代謝物的科學(xué)。作為生物體內(nèi)眾多代謝反應(yīng)的產(chǎn)物，其代 謝物的含量始終處于動(dòng)態(tài)變化中。因此，所謂“代謝組特征” 反映的是來自于活體組織的生物樣本的生理狀況。1 對(duì)于植物來說，其代謝組主要受遺傳基因以及環(huán)境影響等外部 刺激作用而在生長(zhǎng)過程中不斷變化。因而，通過測(cè)試所獲得的 代謝組特征僅為該植物某組織器官在特定生長(zhǎng)階段生理狀況的 剪影。對(duì)樣本中代謝物的定性和定量結(jié)果可作為此代謝組狀態(tài) 的“指紋圖譜”或指示譜圖。據(jù)估計(jì)，所有植物生長(zhǎng)過程中存 在超過 20 萬種代謝物，這些代謝物數(shù)量眾多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣。2 代謝組學(xué)分析的大挑戰(zhàn)在于代謝物結(jié)構(gòu)性質(zhì)的多樣性以及含 量的巨大差異。要對(duì)整個(gè)代謝組體系中的代謝物進(jìn)行測(cè)試，必 須應(yīng)用多種測(cè)試平臺(tái)。 對(duì)于研究可通過化學(xué)衍生法處理進(jìn)行氣相色譜分析的低分子量 代謝物來說，氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）是測(cè)試 工具。在使用氣質(zhì)聯(lián)用儀一級(jí)全掃描模式表征代謝物，可識(shí)別 相關(guān)代謝物并提供其歸一化相對(duì)含量信息，然而，對(duì)代謝物整 體定量研究的要求是獲得準(zhǔn)確的定量信息。在研究大米等 某一植物時(shí)，需要對(duì)作為功能基因組學(xué)工具或區(qū)別不同種屬、 品質(zhì)大米的生物標(biāo)記物的目標(biāo)代謝物進(jìn)行準(zhǔn)確定量

三重四極桿質(zhì)譜儀由于其在復(fù)雜有機(jī)樣本中對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定性 和定量的能力而成為代謝組學(xué)研究中價(jià)值的工具之一。3, 4 三重四極桿質(zhì)譜的主要優(yōu)勢(shì)是利用其多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）功能，一次進(jìn)樣同時(shí)定性和定量上百種代謝物。MRM 數(shù)據(jù)采 集模式通過監(jiān)測(cè)目標(biāo)代謝物*的、保留時(shí)間相關(guān)的母離子子離子轉(zhuǎn)化反應(yīng)，有效消除基質(zhì)和噪音的干擾。并且，共流出 化合物也可以分別定量，無需通過數(shù)學(xué)計(jì)算進(jìn)行解卷積處理。 作為一種食物來源，大米對(duì)于我們至關(guān)重要，它為約 21% 的 人口提供了能量供給（http://www.knowledgebank.irri.org/）。 大米的代謝組研究可用于對(duì)不同大米樣本進(jìn)行“指紋圖譜” 識(shí)別，以鑒定出具有發(fā)展?jié)摿Φ姆N屬，從而揀選更好品質(zhì)、 具備更多營(yíng)養(yǎng)成分的大米。位于菲律賓馬尼拉的稻米研究 機(jī)構(gòu)（International Rice Research Institute, IRRI）是目前亞洲 大的非營(yíng)利性農(nóng)業(yè)研究中心。IRRI 以提高稻米產(chǎn)量和營(yíng)養(yǎng)成 分為目標(biāo)，專注于稻米的新品種開發(fā)。本次分析目的是考察 GC-MS/MS 測(cè)試平臺(tái)對(duì)于檢測(cè)不同基因型成熟稻粒目標(biāo)代 謝物的適宜性。本實(shí)驗(yàn)與 IRRI 合作完成，旨在建立表征不 同種類稻米的代謝特征的測(cè)試流程。

 樣品前處理 大米提取物的衍生化處理依據(jù) Zhou 等人5發(fā)表的用于表征糙 米代謝組學(xué)特征而優(yōu)化的方法完成。將新鮮脫殼的稻粒浸泡于 液氮中，之后研磨過 60 目網(wǎng)篩。稱量 300 毫克糙米粉末，加 入 3 mL 甲醇/水溶液（4:1 v/v），另加入 100 µL 癸酸溶液 （0.30 mg/mL）作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。上述樣本渦旋 1 分鐘并靜置 30 分鐘，經(jīng)超聲處理 60 分鐘后 12000g 離心 10 分鐘。取 2 mL 上清液凍干，加入 90 µL 含 1%*基氯硅烷（TMCS） 的雙*基硅烷基三氟yi酰胺（BSTFA）和 80 µL 吡啶進(jìn)行衍 生化?；旌衔锝?jīng) 75℃ 水浴 45 分鐘后移入裝有 200 µL 內(nèi)插管 的 2 mL 氣相色譜樣品瓶中，用于 GC-MS/MS 分析。所有樣 本均在衍生化處理后 24 小時(shí)內(nèi)完成測(cè)試。5 實(shí)驗(yàn)條件 12 份大米提取物衍生化樣本均應(yīng)用 Thermo ScientificTM TSQTM 8000 三重四極桿 GC-MS/MS 系統(tǒng)聯(lián)用 Thermo ScientificTM TRACETM 1310 氣相色譜分析，氣相色譜儀同時(shí)配備有分流不 分流進(jìn)樣口 SSL 即時(shí)連接的 SSL 模塊和 Thermo ScientificTM TriPlus RSHTM 自動(dòng)進(jìn)樣器。具體儀器方法見表 1。

圖 1 展示了代謝組學(xué)研究的通用測(cè)試流程，首先是第一部分， 無目標(biāo)性地檢測(cè)樣本中化合物成分；之后進(jìn)行第二部分，對(duì)第 一部分中鑒定的代謝物進(jìn)行目標(biāo)性的定量分析。 第一部分分析需要通過對(duì)一級(jí)質(zhì)譜全掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行譜圖數(shù)據(jù)庫(kù) 檢索來完成相關(guān)化合物鑒定。 第二部分分析則通過選擇性反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）模式來對(duì)復(fù)雜 基質(zhì)中痕量化合物進(jìn)行準(zhǔn)確定量。 終用于選擇性定量的多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）是由眾多單獨(dú) 的選擇性反應(yīng)監(jiān)測(cè)組成的。

TSQ 8000 系統(tǒng)同時(shí)進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描和 SRM 掃描的能力出 色，能夠直接采集到第一部分和第二部分所需要所有數(shù)據(jù)。儀器 同時(shí)進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描和 SRM 掃描的能力使得實(shí)驗(yàn)人員可以 在一次測(cè)試中不僅對(duì)已知代謝物定量（目標(biāo)性）的同時(shí)，鑒定未 知代謝物（無目標(biāo)性）。在所有測(cè)試流程中，化合物的色譜保留 時(shí)間是不變的，這一點(diǎn)不僅可作為化合物鑒定的依據(jù)之一，更可 以加快建立目標(biāo)性 MRM 測(cè)試方法進(jìn)程。因此，Thermo Scientific TSQ 8000 三重四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)是同時(shí)進(jìn)行未知化合物表征以及 目標(biāo)化合物廣泛定量的理想測(cè)試平臺(tái)。 本次應(yīng)用 TSQ 8000 GC-MS/MS 系統(tǒng)進(jìn)行代謝組學(xué)研究的兩部分 數(shù)據(jù)對(duì)于深入了解稻米品質(zhì)具有重要參考價(jià)值。

結(jié)果 第一部分—無目標(biāo)性分析 測(cè)試流程中的第一部分，共測(cè)試了 5 種不同的大米樣本。之所以 選擇這幾種大米，是由于它們不同的特性，這樣更有可能測(cè)試出 含量具有顯著差異的代謝物。測(cè)試樣本的一級(jí)全掃描離子流圖見 圖 2。 選擇其中一個(gè)樣本（3 號(hào)樣本）來建立和優(yōu)化 SRM 方法。這個(gè) 樣本中含有大量有意義的代謝物。 TSQ 8000 三重四極桿質(zhì)譜儀配置了全自動(dòng) SRM 離子對(duì)優(yōu)化 （AutoSRM）功能，這個(gè)軟件包可以快速、自動(dòng)化地建立和優(yōu)化 SRM 分析方法。利用該功能建立一個(gè)優(yōu)化 SRM 方法步驟如下：1.分析母離子—根據(jù)一級(jí)全掃描數(shù)據(jù)，選擇出 66 種感興趣的 代謝物，每個(gè)代謝物選擇 2–3 個(gè)母離子。本步驟需要單獨(dú)進(jìn) 行一次 GC-MS/MS 測(cè)試，選擇出的相關(guān)母離子將進(jìn)行進(jìn)一 步的子離子分析。 2.子離子分析—選出在第一步中各代謝物選出的母離子的相應(yīng) 子離子。每個(gè)代謝物均被選出多個(gè)產(chǎn)物離子，這導(dǎo)致每個(gè)代 謝物有 3–7 對(duì)母離子子離子離子對(duì)用于 SRM 優(yōu)化分析。 3.SRM 優(yōu)化分析—優(yōu)化每對(duì)母離子-子離子離子對(duì)的碰撞能 量，以獲得大的離子強(qiáng)度，即靈敏度。在目標(biāo)代謝物進(jìn)入 質(zhì)譜儀后，對(duì)其進(jìn)行快速梯度能量轟擊以提高離子強(qiáng)度。通 過實(shí)時(shí)直接控制儀器，在單次測(cè)試中試驗(yàn)了多個(gè)碰撞能量， 從而極大地縮短了建立和優(yōu)化 SRM 方法所需要的周期。僅 測(cè)試了 5 針樣品就所有 66 種代謝物的 SRM 方法優(yōu)化。 通過質(zhì)譜圖自動(dòng)解卷積和鑒定軟件（AMDIS）對(duì) TSQ 8000 測(cè) 試所得的復(fù)雜離子流圖進(jìn)行解卷積處理，并應(yīng)用美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 與技術(shù)研究院（NIST）的質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行譜圖檢索。上述的 66 種進(jìn)行 AutoSRM 優(yōu)化的代謝物均通過 2011 NIST 質(zhì)譜圖數(shù) 據(jù)庫(kù)檢索匹配其一級(jí)全掃描質(zhì)譜圖以完成鑒定。

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結(jié)論 應(yīng)用 Thermo Scientific TSQ 8000 對(duì) IRRI 提供的不同基因型的 大米進(jìn)行代謝組學(xué)表征研究，旨在鑒定出能夠區(qū)別不同種類、 品質(zhì)大米的潛在生物標(biāo)記物。無論代謝組學(xué)測(cè)試流程中的無目 標(biāo)性分析還是目標(biāo)性定量分析，TSQ 8000 均運(yùn)行良好，展現(xiàn)了 它的一級(jí)質(zhì)譜全掃描、SRM 和同時(shí)進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描 / SRM 掃描模式對(duì)于表征、定量寬動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)的主要代謝物的*優(yōu) 勢(shì)。 盡管 TSQ 8000 質(zhì)譜儀是一臺(tái)三重四極桿質(zhì)量分析器，在一級(jí) 質(zhì)譜全掃描模式下所獲得的譜圖仍與 NIST 標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)具有良好 的匹配度。通過標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索可對(duì)未知化合物進(jìn)行匹配鑒定， 結(jié)果置信度高。同分異構(gòu)體化合物則可根據(jù)其色譜保留時(shí)間不 同而進(jìn)行區(qū)別，并可根據(jù)其特定的質(zhì)譜碎裂特征進(jìn)行選擇性定 量。 利用 TSQ 8000 配置的 AutoSRM 軟件包建立并優(yōu)化大米樣品中 包括氨基酸、有機(jī)酸、脂肪酸、醇類、糖類（單糖、雙糖）在 內(nèi)的 66 種代謝物的 SRM 方法。整個(gè) SRM 方法可在 24 小時(shí)以 內(nèi)建立并完成優(yōu)化，并對(duì) 12 種不同的大米樣品中的代謝物進(jìn)行 測(cè)試。定量結(jié)果具有高重復(fù)率，即使是在基質(zhì)復(fù)雜的衍生化大 米提取物樣品中，超過 90% 的代謝物 RSD 小于 15%。 經(jīng)測(cè)試，所有目標(biāo)代謝物在各大米樣品中含量差異明顯，均有 作為鑒定不同種類大米的生物標(biāo)記物的潛力。本次實(shí)驗(yàn)對(duì)于未 來的水稻多樣性研究打下良好基礎(chǔ)，有助于提高稻谷品質(zhì)和大 米營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。