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賽默飛色譜及質(zhì)譜

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賽默飛混合模式色譜柱方法開(kāi)發(fā)指南 (Ⅰ)

閱讀：432 發(fā)布時(shí)間：2022-8-3

在液相色譜分析中，反相色譜柱 (如Hypersil GOLD C18) 對(duì)強(qiáng)極性或可電離化合物的保留較弱，而離子交換色譜柱 (如Hypersil GOLD SAX) 則對(duì)疏水性強(qiáng)的化合物的保留不足。賽默飛科學(xué)家通過(guò)將離子交換與反相或親水作用的官能團(tuán)創(chuàng)新結(jié)合，在反復(fù)試驗(yàn)并不斷優(yōu)化后，賽默飛混合模式色譜柱應(yīng)運(yùn)而生。

與傳統(tǒng)的反相、親水作用和離子交換色譜柱的單一保留模式相比，賽默飛Acclaim系列混合模式色譜柱的創(chuàng)新型鍵合相，具有du特的表面化學(xué)結(jié)構(gòu)，能夠提供特殊的多重保留機(jī)制，最大限度的優(yōu)化選擇性。通過(guò)調(diào)節(jié)緩沖鹽濃度、pH 值及有機(jī)相比例，在Acclaim系列混合模式色譜上，可實(shí)現(xiàn)同時(shí)保留強(qiáng)極性、中等級(jí)性和弱極性組分，也可以同時(shí)分離酸性、堿性和中性化合物。

認(rèn)識(shí)賽默飛Acclaim系列

混合模式色譜柱

Acclaim Mixed-Mode 系列為雙重混合模式 (Bi-modal)，Acclaim Trinity 系列為三重混合模式 (Tri-modal)，色譜柱混合機(jī)制如圖1 所示。在美國(guó)藥典(USP)色譜柱分類中，Acclaim Mixed-Mode WAX-1和WCX-1分別歸屬于L78和L85。

圖 1 Acclaim Mixed-Mode 系列和Acclaim Trinity 系列色譜柱多重混合機(jī)制示意圖（點(diǎn)擊查看大圖）

1.1 Acclaim Mixed-Mode 系列

Acclaim Mixed-Mode 系列混合模式色譜柱能夠在單一鍵合相上提供多種保留機(jī)制，選擇性與 C18 反相色譜柱互補(bǔ)。

Acclaim Mixed-Mode WAX-1鍵合相為帶有叔胺末端的疏水烷基鏈鍵合硅膠，疏水烴鏈提供反相保留 (RP)，叔胺端基提供弱陰離子交換 (WAX)，適用于酸性化合物分析，如含羧酸、磺酸官能團(tuán)結(jié)構(gòu)，有機(jī)酸類。

Acclaim Mixed-Mode WCX-1鍵合相為帶有羧基末端的疏水烷基鏈鍵合硅膠，疏水烴鏈提供反相保留 (RP)，羧基端基提供弱陽(yáng)離子交換 (WCX)，適用于堿性化合物分析，如含伯仲叔胺及季銨結(jié)構(gòu)，有機(jī)胺類、含氮雜環(huán)結(jié)構(gòu)。

Acclaim Mixed-Mode HILIC-1鍵合相為帶有二醇基末端的疏水烷基鏈鍵合硅膠，疏水烴鏈提供反相保留 (RP)，二醇基端基提供親水作用 (HILIC)，適用于極性和非極性化合物的分離。

圖 2 Acclaim Mixed-Mode 系列雙重混合模式色譜柱鍵合相示意圖（點(diǎn)擊查看大圖）

賽默飛小貼士

Acclaim Mixed-Mode WAX-1 / WCX-1 色譜柱必須始終使用含有緩沖鹽的流動(dòng)相進(jìn)行活化、分析或保存；

Acclaim Mixed-Mode WCX-1 禁止使用醇類作為樣品溶劑或流動(dòng)相。

1.2 Acclaim Trinity 系列

Acclaim Trinity 系列混合模式色譜柱基于 Nanopolymer Silica Hybrid (NSH，納米聚合物硅膠雜化) 技術(shù)，其設(shè)計(jì)旨在使方法開(kāi)發(fā)能夠取得最大的靈活性。全多孔裸硅膠通過(guò)共價(jià)修飾鍵合上具有雙重混合模式的官能團(tuán)，使得硅膠表面帶上電荷，而帶相反電荷的聚合物微球通過(guò)靜電驅(qū)動(dòng)自組裝工藝與改性硅膠進(jìn)行雜化，得到Acclaim Trinity三重混合模式。NSH技術(shù)可以確保內(nèi)孔區(qū)和外表面具有明確的空間分隔，內(nèi)外電荷屬性相反，從而使其同時(shí)具有兩種離子交換保留機(jī)制，并可獨(dú)立控制。

Acclaim Trinity P1硅膠內(nèi)孔區(qū)弱陰離子交換和反相保留 (WAX/RP)，聚合物外表面強(qiáng)陽(yáng)離子交 (SCX)；Acclaim Trinity P2硅膠內(nèi)孔區(qū)弱陽(yáng)離子交換和親水作用 (WCX/HILIC)，聚合物外表面強(qiáng)陰離子交換(SAX)；Acclaim Trinity Q1硅膠內(nèi)孔區(qū)弱陰離子交換和反相保留 (WAX/RP)，聚合物外表面弱陽(yáng)離子交換 (WCX)。

Acclaim Trinity 系列混合模式色譜柱適用于強(qiáng)極性化合物及離子的分析，Trinity P1與Trinity P2選擇性互補(bǔ)，為活性藥物成分與對(duì)離子分析提供全面的解決方案。

圖 3 Acclaim Trinity 系列三重混合模式色譜柱鍵合相示意圖（點(diǎn)擊查看大圖）

賽默飛小貼士

Acclaim Trinity P1 / P2 / Q1 色譜柱必須始終使用含有緩沖鹽的流動(dòng)相進(jìn)行活化、分析或保存；

Acclaim Trinity P2 / Q1 禁止使用醇類作為樣品溶劑或流動(dòng)相；

在使用過(guò)程中應(yīng)避免頻繁大幅度的切換流速，否則會(huì)導(dǎo)致柱壓激增，損傷柱床。

1.3 Acclaim系列混合模式色譜柱理化參數(shù)

表 1 Acclaim系列混合模式色譜柱理化參數(shù)

（點(diǎn)擊查看大圖）

賽默飛Acclaim系列

混合模式色譜柱典型應(yīng)用

由于反相離子對(duì)色譜法，方法穩(wěn)定性差，對(duì)色譜柱損傷大，且與質(zhì)譜不兼容，在接下來(lái)探討酸性堿性化合物分離保留時(shí)，該方法已被排除在外，不在討論之列。

反相液相色譜法分離保留酸性化合物(有機(jī)酸)的機(jī)制，主要是通過(guò)低pH (pKa-2)、高比例水相流動(dòng)相來(lái)實(shí)現(xiàn)。低pH可抑制酸性化合物電離，降低目標(biāo)物極性，高比例水相可減弱流動(dòng)相洗脫強(qiáng)度，增強(qiáng)反相保留，從而達(dá)到分離的目的。當(dāng)方法轉(zhuǎn)移至LC-MS/MS時(shí)，流動(dòng)相會(huì)添加0.1%甲酸來(lái)增強(qiáng)反相保留，而酸性化合物采集模式為負(fù)模式，甲酸的引入勢(shì)必會(huì)抑制負(fù)模式的響應(yīng)。同理，反相液相色譜法分離保留堿性化合物(生物堿)時(shí)，通常會(huì)選擇高pH (pKa+2) 流動(dòng)相來(lái)增強(qiáng)反相保留。針對(duì)液質(zhì)方法，流動(dòng)相一般會(huì)添加0.2‰的氨水，同時(shí)也會(huì)抑制正模式的響應(yīng)。

因此，液質(zhì)方法在分析酸性或堿性化合物時(shí)，會(huì)出現(xiàn)保留與響應(yīng)難以兼顧的情形，而液相方法在同時(shí)分析酸性和堿性化合物時(shí)，會(huì)顯得捉襟見(jiàn)肘。另外，流動(dòng)相較高或較低的pH，對(duì)反相色譜柱及液相系統(tǒng)的耐受性帶來(lái)了新的考驗(yàn)。

采用Acclaim系列混合模式色譜柱分析酸性或堿性化合物時(shí)，可選擇較為“溫和"的流動(dòng)相條件進(jìn)行試驗(yàn)，如乙腈-25mM磷酸氫二銨(pH=5.0)或乙腈-50mM乙酸銨(pH=5.0)，配合調(diào)節(jié)緩沖鹽濃度、pH 值、有機(jī)相比例及柱溫，即可快速完成液相色譜條件的優(yōu)化。目標(biāo)物特征吸收接近紫外端，可選擇磷酸緩沖鹽；配合質(zhì)量型檢測(cè)器時(shí)，須選擇揮發(fā)性緩沖鹽；調(diào)節(jié)緩沖鹽濃度及有機(jī)相比例時(shí)，應(yīng)避免出現(xiàn)鹽析。在整個(gè)方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中，無(wú)須使用離子對(duì)試劑，與質(zhì)譜兼容性較高，可輕松實(shí)現(xiàn)方法轉(zhuǎn)移，在食品極性農(nóng)獸殘分析及藥物極性雜質(zhì)譜研究中有著廣泛的應(yīng)用前景。

2.1 酸性/堿性化合物的分析