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神經(jīng)生長因子（NGF）是1951年是由諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎獲得者R. LeviMontalcini和S. Cohen在小鼠肉瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的。NGF是一種蛋白質(zhì)，含三種亞基α、β、γ，以α2βγ2五個亞基組成，分子量為1300000，通常稱為7S NGF。只有β亞基具有促進(jìn)神經(jīng)生長的作用，用不同方法提取可以得到一種2.5S的NGF，大致相當(dāng)于β亞基部。由兩個118個氨基酸組成的單鏈通過非共價鍵結(jié)合而成的二聚體，分子量為26600左右，等電點(diǎn)是9.3，不同種間NGF的結(jié)構(gòu)具有高度的同源性，生物效應(yīng)也無明顯的種間特異性。圖2-21為經(jīng)典的NGF空間分子結(jié)構(gòu)，紅色：α亞基（功能尚不清楚），綠色：γ亞基（具有蛋白酶活性），藍(lán)色：β亞基（具有生物活性的NGF）。目前有較多的文獻(xiàn)采用反相高效液相色譜的方法進(jìn)行快速簡便的NGF含量的測定，但是作為生物活性物質(zhì)，NGF在有機(jī)相（乙腈或者甲醇）的條件下會發(fā)生不可逆的生物活性變性，因此本文考慮采用離子交換液相色譜方法對NGF進(jìn)行離子交換模式下的分離，在緩沖液的條件下保持了NGF的生物活性，使分析的過程更接近生物體液環(huán)境，同時考察了不同的pH條件對NGF分離的影響。各種不同分離方法色譜條件見表2-16、2-17，各分離模式下柱溫均為30 ℃，進(jìn)樣量10 µL，檢測波長280nm。分析圖譜見圖2-22到2-24。

（1）反相色譜條件：色譜柱：Acclaim300 C18，3 µm，3×150 mm， P/N：063684流動相：A：0.1%TFA超純水； B：0.1%TFA乙腈；流速：0.50 mL/min梯度洗脫見表2-16：

（2）體積排阻色譜條件：色譜柱：Mab Pac SEC-1，5 µm，4.0×300 mm， P/N：074696流動相：50 mmol/L磷酸鈉緩沖液pH=6.8和 0.3 mol/L的NaCl的混合溶液流速：0.20 mL/min（3）離子交換色譜條件：色譜柱：MAb Pac SCX-10，10 µm，4.0×250 mm， P/N：074625流動相：A：Tris緩沖液pH=7.2， B：Tris緩沖液加0.5mol/L的NaCl，pH=7.2；流速：1.0 mL/min梯度洗脫條件見表2-17：

本實(shí)驗(yàn)分別采用反相、體積排阻和離子交換的色譜方法分離了NGF（神經(jīng)生長因子）。反相色譜條件測定選擇了適于測定蛋白成分的孔徑為300?的色譜柱；體積排阻色譜采用MabPac SEC-1柱同時進(jìn)樣的還有牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白和細(xì)胞色素C，由圖2-23可知，客戶提供NGF樣品的色譜峰與細(xì)胞色素C（MW=12KDa）的保留時間比較接近，因此其分子量可能為13-14KDa，是由118個氨基酸構(gòu)成的單鏈，而沒有形成二聚體。在體積排阻的色譜圖上可以看到除了主峰，基本沒有小雜峰，所以可以認(rèn)為NGF樣品中沒有小片段的雜蛋白的影響。采用離子交換色譜方法分離NGF時，色譜柱和流動相的pH選擇對樣品的影響較大，而且之前鮮有采用離子交換的方法分離NGF的報道。根據(jù)NGF（二聚體）的pI約為9.3，因此考慮采用MAbPac SCX-10陽離子交換的色譜柱對其進(jìn)行分析，改變了不同的梯度條件，但在流動相pH為5.6和6.5的條件，NGF在色譜柱基本沒有保留，很快就出峰，說明在此pH條件下，NGF蛋白整體可能呈電中性或者帶負(fù)電荷，導(dǎo)致其在陽離子色譜柱上沒有保留。后將流動相pH分別調(diào)節(jié)到7.1、7.2和7.3，比較了不同的結(jié)果。將pH調(diào)節(jié)為7.3時，改變不同的梯度條件，NGF還是為一個峰，而前面的小雜峰能夠較好分離。因此流動相的pH對NGF分離的影響比較大，能夠?qū)GF樣品中具有電荷差異的樣品進(jìn)行分離。