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原創(chuàng) 飛飛 賽默飛色譜與質(zhì)譜中國

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齊英姿

Literature sharing

本次我們分享兩篇文章，分別于2022年09月和2022年10月發(fā)表于bioRxiv [1-2]，文章內(nèi)容為在單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域，使用基于PD3.0_CHIMERYS檢索及質(zhì)譜寬隔離窗口采集的方法，搭配全新的μPAC 色譜柱的賽默飛綜合解決方案，提升單細(xì)胞蛋白質(zhì)鑒定的性能。接下來我們分別進(jìn)行具體的介紹。

基于DDA采集模式與單細(xì)胞組學(xué)的低離子數(shù)目的特點，采用更大的隔離窗口，增加共隔離的離子數(shù)目，這是一種被認(rèn)為是類似于結(jié)合了傳統(tǒng)的DDA與DIA的采集方法，文獻(xiàn)中將這個方法稱之為寬隔離窗口采集（wide window acquisition ,WWA)策略(如圖1所示)。

圖1：wide window acquisition (WWA)寬隔離窗口采集策略（點擊查看大圖）

PD軟件3.0版本自2022年年中發(fā)布以來，其對DDA蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的性能提升有目共睹；如需CHIMERYS的介紹，可具體參考以下鏈接

《好風(fēng)憑借力：CHIMERYS實現(xiàn)蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的性能飛躍》

——賽默飛orbitrap組學(xué)俱樂部公眾號

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基于AI算法的CHIMERYS搜索引擎，可在一張二級譜圖中解析出多個PSMs，擅長于解析WWA采集得到的更加復(fù)雜的二級譜圖。

作為 LC-MS/MS的重要組成部分的低流速液相色譜，對減少樣品的復(fù)雜度、增加蛋白質(zhì)組學(xué)的鑒定方面的貢獻(xiàn)尤為重要，通常我們可以通過拉長色譜梯度等方法來實現(xiàn)更好的分離，而這也會引入包括峰展寬在內(nèi)的靈敏度的降低及檢測通量的降低等問題。而新發(fā)布的微柱蝕刻技術(shù)的μPAC系列色譜柱，具有高度有序的排列，有助于更加優(yōu)異的峰寬表現(xiàn)且減小柱殘留，低背壓的設(shè)計也使其可以使用更大的流速，可以更快的上樣、清洗及平衡色譜柱，從而增加檢測通量(賽默飛提供的綜合解決方案如圖2所示)。

圖2：結(jié)合了低流速液相色譜、質(zhì)譜及分析軟件的完整綜合解決方案（點擊查看大圖）

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不同的色譜柱性能比較

在色譜柱的比較中，與傳統(tǒng)的填充柱相比，作者對比了110cm的第二代μPAC色譜柱與其他兩款填充型色譜柱(50cm及25cm)，如圖3所示，上樣量為12.5ng Hela肽段，30min有效梯度，采用1Th的采集窗口，第二代μPAC色譜柱可以得到蛋白水平66%和肽段水平140%的提升。

而比較不同的μPAC色譜柱（5.5cm原型柱、50cm Neo柱和110cm二代柱），使用復(fù)雜樣品(HeLa, yeast, 和 E. coli按照8:1:1混樣)，10ng-400ng的上樣區(qū)間，蛋白鑒定結(jié)果如圖3所示。50cm的Neo色譜柱，在30min及60min梯度上具有優(yōu)異的表現(xiàn)，特別是在低上樣量的條件下。我們需要的樣品的通量(梯度時間)及樣品的復(fù)雜度則決定了WWA方法對單細(xì)胞樣品的適用性，樣品通量是單細(xì)胞蛋白組學(xué)領(lǐng)域的重要關(guān)注點，使用5.5cm色譜柱搭配高流速，可實現(xiàn)到~100spd的水平。

圖3：不同的色譜柱性能比較

（點擊查看大圖）

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隔離窗口的優(yōu)化

在WWA方法中，若使用了＞4m/z的較寬的母離子隔離窗口，使得臨近的母離子被共同碎裂，這時二級譜圖會形成類似于DIA采集方法的混合譜，這種方法不僅能增加鑒定數(shù)，還能提高鑒定時對低豐度肽段的靈敏度；對不同大小的隔離窗口進(jìn)行優(yōu)化，在250pg到400ng的上樣區(qū)間中，可以看到，更寬的隔離窗口更適合較小上樣量的結(jié)果，如250pg和1ng的上樣量下，隔離窗口12m/z和8m/z為最適效果。搭配于CHIMERYS的檢索方法，更大的隔離窗口所提供的譜圖復(fù)雜度，使得對低豐度肽段有更好的挖掘，拓寬了鑒定的豐度的動態(tài)范圍。

圖4：不同上樣量條件下隔離窗口的優(yōu)化

（點擊查看大圖）

在質(zhì)譜方法中，單細(xì)胞的樣品由于離子數(shù)更少，往往需要更高的最大離子注入時間，比如幾百個毫秒，這會導(dǎo)致二級譜圖數(shù)的降低，從而顯著的影響鑒定量。此時我們也可以配合使用更高的分辨率，可以識別更加復(fù)雜的離子，也就是說，我們可以使用更大的隔離窗口來提供更多的離子進(jìn)行累積，并且通過高分辨率來識別這些離子，而后我們可以通過PD3.0 CHIMERYS引擎來對這些復(fù)雜的混合譜圖進(jìn)行檢索。

使用經(jīng)典的窄隔離窗口采集方法，與傳統(tǒng)的MS Amanda 2.0 引擎相比，CHIMERYS引擎可提升鑒定量2.6倍；而再加成上寬隔離窗口的WWA采集方法后，則可達(dá)到4.6倍的提升水平。

圖5：CHIMERYS搜索引擎提升蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定深度

（點擊查看大圖）

另一篇文獻(xiàn)中，作者使用0.2ng Hela肽段，對不同的隔離窗口、最大離子注入時間、分辨率等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在MS2分辨率為45k和60k時，我們能夠得到最多的PSMs鑒定數(shù)。在隔離窗口為8或者12Th時，會得到最好的結(jié)果。0.2ng Hela的上樣量，WWA模式可達(dá)到2,396個蛋白鑒定，比普通DDA模式鑒定量增加39%。

圖5：采用0.2ngHela肽段及40min對WWA模式質(zhì)譜采集參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化（點擊查看大圖）

在短梯度模式下，峰容量降低，使其譜圖的復(fù)雜度更高?；?/span>CHIMERYS的破解高度復(fù)雜的混合譜的能力，使得更快的色譜分析成為可能。在使用12Th的隔離窗口與60k MS2分辨率的組合條件下，可得到最好的鑒定能力。使用此參數(shù)組合，更快的20min的鑒定量僅比40min少了10%（3160 vs 3524）。這說明，在并未顯著影響蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定量的條件下，WWA的采集方法適用于更快速的梯度分離。

由于WWA采集方法被認(rèn)為是類似于結(jié)合了傳統(tǒng)的DDA與DIA的方式，故文章對不同的采集模式進(jìn)行了比較；在單細(xì)胞水平的比較中（10個Hela細(xì)胞及7-10個K562細(xì)胞），使用相同的118ms和60K分辨率的二級參數(shù)，定性深度的比較中，WWA采集方法可得到最多的鑒定。

圖6：不同的采集模式（DIA, DDA 及 WWA）比較

（點擊查看大圖）

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結(jié)語

WWA采集方案的提出，為我們進(jìn)行快速的、更高深度的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)提供了新的思路：基于賽默飛綜合解決方案，我們從全新的Vanquish neo低流速液相色譜、μPAC色譜柱、寬隔離窗口的質(zhì)譜采集策略以及全新的基于AI算法的CHIMERYS搜索引擎，全方面提升單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定深度。

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