新國標應對—GB 5009.35-2023 食品中 11 種合成著色劑的測定

引言

合成著色劑是人工合成的使食品著色和改善食品色澤的物質(zhì)[1]，具有色澤鮮艷、性質(zhì)穩(wěn)定、成本低廉以及著色力強等特點，廣泛應用于各類食品中，如糖果、糕點、蜜餞、飲料、罐頭等。合成著色劑在現(xiàn)代食品工業(yè)中扮演著不可或缺的角色，賦予食品豐富的顏色，為消費者呈現(xiàn)出多樣的選擇。然而，隨著人們對食品質(zhì)量安全的日益關切，因合成著色劑生產(chǎn)環(huán)節(jié)的濫用以及消費環(huán)節(jié)的過量攝入而導致的一些列潛在危害，也引發(fā)了社會各界的廣泛關注和討論。

近期，食品安全國家標準審評委員會審查通過并發(fā)布了 85 項食品安全國家標準，其中包含了合成著色劑的檢測標準— GB 5009.35-2023。

GB 5009.35-2023 新國標變化[2][3]：

1. GB 5009.35-2023 于 2023-09-06 正式發(fā)布，2024-03-06 正式實施；

2. GB 5009.35-2023 代替 GB 5009.35-2016、GB 5009.141-2016、GB/T 9695.6-2008、GB/T 21916-2008；

3. 相較于 GB5009.35-2016，GB 5009.35-2023 增加了靛藍、誘惑紅、酸性紅和喹啉黃 4 種合成著色劑，增加和明確了適用基質(zhì)種類，修改了樣品前處理方法和儀器條件，修改了檢出限和定量限。

賽默飛新國標應對方案亮點：

1. 賽默飛實驗室完全參照標準梯度洗脫程序進行方法復現(xiàn)，為進一步優(yōu)化靈敏度和分離度，僅將柱溫提升至 35℃；

2. 檸檬黃和新紅、喹啉黃-5 與莧菜紅、喹啉黃-6 與胭脂紅、日落黃與喹啉黃-2、酸性紅與喹啉黃-3 均可基線分離，實現(xiàn)準確定性和定量；

3. 酸性紅出峰位置在亮藍-1 之后，不會干擾亮藍-3 的定性定量，分離和保留效果優(yōu)于標準提供的參考譜圖；

4. 基于 Chromeleon 7.3 數(shù)據(jù)處理軟件，采用化合物組模式對喹啉黃和亮藍的多個異構體進行準確定量，提升工作效率。

GB 5009.35-2023 賽默飛應用解決方案

01儀器配置及色譜條件

液相色譜儀：Vanquish™ Core HPLC 液相色譜系統(tǒng)，配合變色龍數(shù)據(jù)處理軟件

色譜柱：

Acclaim 120 C18, 5 μm, 4.6×250 mm (P/N: 059149)

Betasil C18, 5 μm, 4.6×250 mm (P/N: 70105-254630)

四元泵 Pump: VC-P20-A

流動相：A: 20 mM 乙酸銨  B: 甲醇

流速：1.0 mL/min

梯度洗脫程序：

自動進樣器 Sampler Module: VC-A12-A

進樣量：10 μL；樣品盤溫度：15 ℃

柱溫箱 Column Comp: VC-C10-A

柱溫：35 ℃

檢測器 DAD: VC-D11-A (UV/Vis)

采集波長：415 nm, 520 nm, 610 nm；

采集頻率：5 Hz；

光譜采集：400-800 nm

02譜圖及數(shù)據(jù)

2.1

Acclaim 120 C18 應用于 11 種合成著色劑的分離

圖 1 415/520/610 nm 下，11 種合成著色劑分離疊加譜圖 (20.0 μg/mL, 10 μL)

圖 2 415 nm 下，檸檬黃和喹啉黃分離譜圖及數(shù)據(jù)  (20.0 μg/mL, 10 μL)

圖 3 520 nm 下，新紅等 7 種合成著色劑分離譜圖及數(shù)據(jù)  (20.0 μg/mL, 10 μL)

圖 4 610 nm 下，靛藍和亮藍分離譜圖及數(shù)據(jù)  (20.0 μg/mL, 10 μL)

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2.2

喹啉黃與亮藍異構體的分離

2.2.1 喹啉黃異構體的分離

食品添加劑喹啉黃是由 2-(2-喹啉基)-1,3-茚二酮 （Ⅰ型）或 三分之二 2-(2-喹啉基)-1,3-茚二酮和三分之一 2-[(6-甲基喹啉基)]-1,3-茚二酮的混合物（Ⅱ型）磺化而制得的。其中，Ⅰ型工藝產(chǎn)品主成分為 2-(2-喹啉基)-茚滿基-1,3-二酮二磺酸二鈉鹽 (≥80.0%)，2-(2-喹啉基)-茚滿基-1,3-二酮單磺酸鈉鹽 (≤15.0%)，2-(2-喹啉基)-茚滿基-1,3-二酮三磺酸三鈉鹽 (≤7.0%)，副染料 2-(2-喹啉基)-1,3-茚二酮 和 2-[(6-甲基喹啉基)]-1,3-茚二酮 (≤4.0%)；Ⅱ型工藝產(chǎn)品主成分為 2-(2-喹啉基)-茚滿基-1,3-二酮二磺酸二鈉鹽 (≥70.0%)，副染料 2-(2-喹啉基)-1,3-茚二酮 和 2-[(6-甲基喹啉基)]-1,3-茚二酮 (≤4.0%)[4]。由于在磺化反應過程中取代位點的不同，使得 2-(2-喹啉基)-茚滿基-1,3-二酮二磺酸二鈉鹽 QYNa2 有兩種異構體 QYNa2Ⅰ和 QYNa2Ⅱ，2-(2-喹啉基)-茚滿基-1,3-二酮單磺酸鈉鹽 QYNa 也有兩種異構體 QYNaⅠ和 QYNaⅡ[5]。

因此，食品添加劑喹啉黃由于合成及純化工藝的差異，在色譜分離時會出現(xiàn)多個色譜峰，相同的發(fā)色基團在 415 nm 下，最多可能有 7 個色譜峰；而標準品喹啉黃通常是經(jīng)色譜制備純化除去副染料，最多可能分出 5 個色譜峰。如圖 5 所示，喹啉黃的 7 個組分光譜圖高度相似，喹啉黃-1/2/3/4 與新國標標記的 4 個喹啉黃組分出峰順序及保留時間相一致，喹啉黃-5/6/7 可能是 QYNa3 或副染料成分，時常會因色譜分離不充分而被混標中其他相鄰峰包埋，進而被忽視。

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圖 5 415 nm 下，喹啉黃異構體分離譜圖  (100.0 μg/mL, 5 μL)（點擊查看大圖）

2.2.2 亮藍異構體的分離

食品添加劑亮藍的合成工藝路線是由一份苯甲醛鄰磺酸與兩份 N-乙基-N-(3-磺基芐基)-苯胺為原料經(jīng)縮合、氧化而制得[6]。其中，N-乙基-N-(3-磺基芐基)-苯胺系 N-乙基-N-芐基苯胺磺化而得，磺化位置主要在其芐基上的間位，其次對位，鄰位磺化則較難。由于難以分離故 N-乙基-N-(3-磺基芐基)-苯胺的工業(yè)品實際是三個異構體的混合物，一般大致組成為間位物 (m) : 對位物 (p) : 鄰位物 (o)=75~85 : 15~20 : 0~8。因此，制得的亮藍商品色素其主成分亦應是 m-m、m-p、m-o、p-p、p-o、o-o 6 個同分異構體的混合物[7]。而 o-o 和 o-p 同分異構體的占比非常低，市售工藝純亮藍的液相色譜圖通常會呈現(xiàn)出 4 個色譜峰。如圖 6 所示，亮藍的  4 個組分光譜圖高度相似，亮藍-1/2 與新國標標記的 2 個亮藍組分出峰順序及保留時間相一致，亮藍-3/4 在標準中被忽略掉了，其中亮藍-3 可能會受到酸性紅的干擾。

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圖 6 610 nm 下，亮藍異構體分離譜圖  (100.0 μg/mL, 5 μL)（點擊查看大圖）

2.3

11 種合成著色劑標準系列工作液校準曲線

圖 7 檸檬黃和喹啉黃 線性疊加譜圖 (0.20-10.0 μg/mL, 10 μL)

圖 8 新紅等 7 種合成著色劑 線性疊加譜圖 (0.20-10.0 μg/mL, 10 μL)

圖 9 靛藍和亮藍 線性疊加譜圖 (0.20-10.0 μg/mL, 10 μL)

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2.4

樣品及樣品加標譜圖

圖 10 維生素功能飲料樣品及樣品加標譜圖 （檸檬黃、胭脂紅有檢出）

圖 11 茉莉花茶樣品及樣品加標譜圖

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2.5

喹啉黃和亮藍異構體的定量

圖 12 喹啉黃和亮藍異構體采用化合物組進行定量示意圖

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Tips: 關于化合物組定量，想要了解更多變色龍軟件的操作細節(jié)？歡迎咨詢賽默飛液相色譜應用團隊

2.6

Betasil C18 應用于  11 種合成著色劑的分離

（補充方案）

圖 13 Betasil C18 應用于  11 種合成著色劑分離譜圖 (20.0 μg/mL, 10 μL)（點擊查看大圖）

03GB 5009.35-2023 相關色譜耗材推薦

參考文獻：

[1] GB 5009.35-2023 食品安全國家標準 食品中合成著色劑的測定

[2] GB 5009.35-2016 食品安全國家標準 食品中合成著色劑的測定

[3] GB 2760-2014 食品安全國家標準 食品添加劑使用標準

[4] GB 1886.104-2015 食品安全國家標準 食品添加劑 喹啉黃

[5] DBS32/ 012-2016 食品安全地方標準 食品中喹啉黃的檢測 高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法

[6] GB 1886.217-2016 食品安全國家標準 食品添加劑 亮藍

[7] 丁秋龍,王麗斌,陳建新. 食用亮藍色素之同分異構體研究