液相色譜是現(xiàn)在食品實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用非常廣泛的一款儀器，但是還有很多小伙伴對(duì)它的原理、使用維護(hù)等知識(shí)不太了解。今天小編就從HPLC概述、工作原理、結(jié)構(gòu)組成、常見故障及維護(hù)、HPLC應(yīng)用等方面來給大家科普下HPLC的基礎(chǔ)知識(shí)。

1 液相色譜法概述

液相色譜法(HPLC)是上個(gè)世紀(jì)七十年代迅速發(fā)展起來的一項(xiàng)、快速的分析分離技術(shù)，是現(xiàn)代分離測(cè)試的重要手段。色譜法的分離原理是：溶于流動(dòng)相(mobile phase)中的各組分經(jīng)過固定相時(shí)，由于與固定相(station phase)發(fā)生作用(吸附、分配、排阻、親和)的大小、強(qiáng)弱不同，在固定相中滯留時(shí)間不同，從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。

HPLC是在經(jīng)典的液相色譜法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，其以液體作為流動(dòng)相，并采用顆粒極細(xì)的固定相的柱色譜分離技術(shù)。其分離機(jī)制與常規(guī)柱色譜相同，但填料更加精細(xì)，需高壓泵推動(dòng)，柱效高，分析速度快。與氣相色譜不同的是液相色譜中流動(dòng)相亦參與組分的分離過程，其組成、比例和pH值可靈活調(diào)節(jié)，分離模式多樣。在實(shí)際操作中主要通過改變流動(dòng)相的組成來調(diào)節(jié)樣品在色譜柱的保留值和選擇性，從而使不同樣品得到分離。

液相色譜法自20世紀(jì)60年代問世以來，由于使用了高壓輸液泵、全多孔微粒填充柱和高靈敏度檢測(cè)器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)樣品的高速、和高靈敏度的分離測(cè)定。液相色譜由于吸取了經(jīng)典液相色譜的研制經(jīng)驗(yàn)，并引入微處理機(jī)技術(shù)，極大的提高了儀器的自動(dòng)化水平和分析精度?，F(xiàn)在用微處理機(jī)控制的液相色譜儀，其自動(dòng)化程度很高，既能控制儀器的操作參數(shù)(如溶劑梯度洗脫、流動(dòng)相流量、柱溫、自動(dòng)進(jìn)樣、洗脫液收集、檢測(cè)器功能等)，又能對(duì)獲得的色譜圖進(jìn)行收縮、放大、疊加，以及對(duì)保留數(shù)據(jù)和峰高、峰面積進(jìn)行處理等，為色譜分析工作者提供了率、功能齊全的分析工具。

液相色譜法的應(yīng)用范圍十分廣泛，對(duì)樣品的適用性廣，不受分析對(duì)象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，幾乎所有的化合物包括高沸點(diǎn)、極性、離子型化合物和大分子物質(zhì)均可用液相色譜法分析測(cè)定，因而彌補(bǔ)了氣相色譜法的不足。在目前已知的有機(jī)化合物中，可用氣相色譜分析的約占20% ，而80% 則需用液相色譜來分析。HPLC因其具有分離效能高、分析速度快、檢測(cè)靈敏度好、能分析和分離高沸點(diǎn)且不能氣化的熱不穩(wěn)定生理活性物質(zhì)的特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、藥物及臨床分析，世界各國(guó)己將該法收載于藥典。

火焰離子化檢測(cè)器、手性、化學(xué)發(fā)光、核磁共振、質(zhì)譜檢測(cè)器等新型檢測(cè)技術(shù)

GC與LC的比較

由于HPLC分析不受溫度和樣品沸點(diǎn)限制，因此具有更廣闊的應(yīng)用潛力。經(jīng)過30多年的迅速發(fā)展，液相色譜法在基礎(chǔ)理論、儀器裝置和色譜柱等方面的研究已趨于成熟，現(xiàn)已成為化學(xué)化工、環(huán)境、藥學(xué)、食品等多個(gè)領(lǐng)域中相當(dāng)有優(yōu)勢(shì)的分離分析方法之一。

2 基本原理

液相色譜根據(jù)分離機(jī)理的不同可分為：

¬液固吸附色譜

¬液液分配色譜

¬離子交換色譜

¬離子對(duì)色譜法

¬分子排阻色譜(或凝膠滲透色譜)

（一）液-固吸附色譜

流動(dòng)相為液體，固定相為固體吸附劑，根據(jù)物質(zhì)吸附作用的不同來分離物質(zhì)。

（二）液-液分配色譜

流動(dòng)相和固定相都是液體的色譜法即為液-液色譜，是利用樣品組分在兩種不相溶的液相間的分配來進(jìn)行分離。一種液相為流動(dòng)相，另一種是涂于載體上的固定相。

流動(dòng)相極性小于固定相極性的液-液色譜法稱為正相分配色譜法。

流動(dòng)相極性大于固定相極性的液-液色譜法稱為反相分配色譜法。

（三）離子交換色譜

（四）離子對(duì)色譜法

（五）分子排阻色譜法

3 結(jié)構(gòu)組成

（1）泵的基本原理

（2）儀器：四元泵

（3）儀器：手動(dòng)進(jìn)樣器——六通閥/定量環(huán)

（4）儀器：自動(dòng)進(jìn)樣器

（5）色譜柱：柱溫箱、色譜柱外掛架

（6）儀器：檢測(cè)器——紫外

（7）儀器：化學(xué)工作站

（8）固定相與流動(dòng)相

（9）流動(dòng)相（反相）

4 常見故障及維護(hù)

4.1 HPLC對(duì)流動(dòng)相的一般要求

流動(dòng)相就比如人體的血液，其質(zhì)量直接影響到整個(gè)系統(tǒng)的正常運(yùn)行與否。

應(yīng)該使用HPLC級(jí)的溶劑，不能互相混溶的溶劑不可以直接切換！一般在水相和與其不混溶的溶劑切換時(shí)，使用異丙醇作為過渡溶劑。

注意溶劑的截止波長(zhǎng)。截止波長(zhǎng)是指該溶劑可以在紫外檢測(cè)器中使用的低波長(zhǎng)，低于該波長(zhǎng)后，溶劑會(huì)有很強(qiáng)的紫外吸收，從而影響極限的穩(wěn)定性、干擾對(duì)所分析物質(zhì)的檢測(cè)。

HPLC所使用的水必須是新鮮的和經(jīng)過0.45μm濾膜過濾過的。建議每天更換新鮮的水。長(zhǎng)期不用時(shí)，必須把使用水的管路用有機(jī)溶劑置換，防止長(zhǎng)霉。

儀器使用完后要采用適當(dāng)?shù)娜軇_洗等方法維護(hù)色譜柱和系統(tǒng)。如果使用了緩沖鹽一定先將鹽要沖洗干凈。

儀器長(zhǎng)期不用時(shí)，不建議使用純乙腈封存。因?yàn)橐译嬗猩删酆衔锏内厔?shì)。建議使用甲醇、甲醇/水或乙腈/水封存。

當(dāng)有流路堵塞時(shí)，可以嘗試將之反接后沖洗。污染的溶劑或溶劑瓶里的藻類生長(zhǎng)將會(huì)縮短溶劑過濾器的使用壽命，并且影響泵和系統(tǒng)的的性能。這在水溶劑或磷酸鹽緩沖液(pH 4 至7) 中尤其如此。

4.1.1 過濾器

•檢查溶劑過濾器

查看過濾器是否變色(尤其是盛放水相的溶劑瓶)–擰開脫氣機(jī)出口或比例閥入口管線，此時(shí)溶劑會(huì)因?yàn)橹亓α鞒?。?dāng)脫氣機(jī)或溶劑過濾頭堵塞時(shí)，溶劑會(huì)流出不暢或不流出–臨時(shí)取下過濾器，檢查柱前壓力是否正常。

•清潔溶劑過濾器

將堵塞的溶劑過濾器從瓶頭組件中拿下，用水沖洗殘留之溶劑，然后將過濾器放在裝有濃硝酸(35％左右)的燒杯里浸一小時(shí)。用二次蒸餾水*沖洗過濾器至水為中性可以把過濾器放在塑料燒杯內(nèi)超聲清洗。但是不可使用玻璃器皿將過濾器重新裝好。

•建議：定期清洗溶劑過濾器及溶劑瓶（可以高溫滅菌），每三個(gè)月至少清洗一次。

4.1.2 泵的使用要點(diǎn)

?將裝有溶劑瓶的溶劑箱放在泵上面或較高處。當(dāng)在四元泵上使用鹽溶液或有機(jī)溶劑時(shí)，建議將鹽溶液接在下面的梯度閥口上，將有機(jī)溶劑接在上面的梯度閥口上，有機(jī)溶劑通道在水或鹽溶液通道的正上面。建議用水定期沖洗所有MCGV通道除去可能在閥口析出的鹽結(jié)晶。

?操作泵之前，用至少兩個(gè)體積（標(biāo)準(zhǔn)脫氣機(jī)30mL，對(duì)微脫氣機(jī)10mL）沖洗真空脫氣機(jī)，特別是當(dāng)泵關(guān)閉了一段時(shí)間后(例如，過夜)，以及在通道中使用揮發(fā)性混合溶劑時(shí)，防止溶劑瓶?jī)?nèi)的玻璃濾頭(過濾器)堵塞及長(zhǎng)菌，當(dāng)濾頭表面有黑色或黃色污染層說明發(fā)生了堵塞，應(yīng)立即清洗或更換。

?定期檢查排液閥的過濾白頭。檢查方法：擰開排液閥，以水作流動(dòng)相。

對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)脫氣機(jī)(G1322A)，流速5ml/min水，若壓力大于10bar，則建議更換。

對(duì)于微量脫氣機(jī)(G1379A)，流速2ml/min水，若壓力大于5bar，則建議更換。

?當(dāng)使用低流速時(shí)，檢查所有1/16英寸接頭有無滲漏（用壓力測(cè)試或漏液測(cè)試。每當(dāng)更換泵密封墊時(shí)排液閥慮芯也應(yīng)更換。

?更換活塞密封墊時(shí)檢查活塞桿上是否有劃痕。有劃痕的活塞將導(dǎo)致輕度滲漏，并降低密封墊的使用壽命。應(yīng)盡早更換有劃痕的活塞。

?使用緩沖溶液時(shí)，關(guān)泵前先用水沖洗系統(tǒng)。當(dāng)需要長(zhǎng)時(shí)間使 用0.1摩爾或更高濃度的緩沖液時(shí)，選用密封墊清洗附件，以減少對(duì)密封墊及活塞桿的磨損。

?如果使用了高濃度的緩沖鹽，可以考慮用熱水（50－60℃）來沖洗鹽通道來確保沒有緩沖鹽殘留在系統(tǒng)中。

?更換活塞密封墊后應(yīng)按照密封墊安裝步驟對(duì)其進(jìn)行磨合，但磨合不適用于正相密封墊。

?當(dāng)泵頭安裝有柱塞清洗附件時(shí)，由于該附件中也有密封墊，這樣就會(huì)增加活塞桿運(yùn)動(dòng)時(shí)的阻力。所以開泵前一定要用10％異丙醇，并將其流速調(diào)至約2－3滴/分鐘使溶液流過沖洗裝置。(對(duì)于二元泵SL，如果不使用鹽溶液可以不開)10％異丙醇有助于降低水的表面張力，并有抑菌作用。不要用其它溶劑代替。

?當(dāng)泵頭安裝有沖洗附件而不開啟10％異丙醇，會(huì)使密封墊及活塞桿的壽命減短(二元泵SL除外)，泵頭如果發(fā)出“吱吱”聲不影響使用和泵的精度如果有必要，可以改變壓縮因子（compressibility）來達(dá)到更好的效果。

4.1.3 自動(dòng)進(jìn)樣器

樣品在進(jìn)樣前必須經(jīng)過適當(dāng)?shù)念A(yù)先處理，需要經(jīng)過亞微米濾膜的過濾或者離心，防止樣品中的微小顆粒堵塞管路，使用流動(dòng)相作為溶劑配制樣品，所用溶劑應(yīng)該對(duì)樣品有較好的溶解性。

針座是喇叭口朝上暴露在空氣中的，有時(shí)空氣中的較大灰塵顆?？赡芮『寐湓卺樧牧髀穬?nèi)而引起針座的堵塞。這時(shí)候可以嘗試卸下針座，將它接在泵的出口上反沖，一般能解決問題。

如果經(jīng)常使用緩沖溶液，除了泵頭之外，ALS計(jì)量泵的柱塞及密封圈，六通閥的轉(zhuǎn)子密封圈和定子密封圈應(yīng)該定期清洗，防止有鹽的顆粒磨損ALS一定要使用Agilent的樣品瓶及瓶蓋；使用不兼容的或者加工精度差的樣品瓶及瓶蓋會(huì)引起ALS故障率的增加及性能的降低。

4.1.4 DAD常見故障及原因

4.2 HPLC日常維護(hù)

4.3 HPLC常見故障診斷

5 HPLC的應(yīng)用

在環(huán)保方面，HPLC可以應(yīng)用在：

（1）農(nóng)藥殘留量分析 ：含氯農(nóng)藥 、有機(jī)磷  農(nóng)藥 、除蟲菊等；

（2）致癌物質(zhì)：硝基呋喃及其代謝物、霉素、亞硝胺、苯并芘等；

（3）水質(zhì)分析：內(nèi)分泌污染物等；

（4）其它……

在生化方面，HPLC可以應(yīng)用于：

（1）蛋白質(zhì)分析；

（2）肽類的分析；

（3）核酸；

（4）氨基酸 ；

（5）其它……