活死細菌、細胞檢測

-----探尋生命的奧秘

背景介紹

真核生物（哺乳動物細胞）和原核生物（細菌）細胞增殖和細胞死亡間平衡對維持細胞有機的發(fā)育與生命的維持至關重要，如果出現失衡將導致各種疾病的發(fā)生。活死狀態(tài)是研究生物增殖生長的常見研究目的，例如；對于真核活死細胞主要通過分析細胞質膜完整性與細胞內酯酶活性，經過特定儀器觀察判斷，為研究細胞狀態(tài)提供了一種方便的方法，同時分析活細胞與死細胞，用于評估細胞的活力。可以應用于大多數的真核哺乳動物細胞，但不適用于真菌和酵母。主要對于藥物研究、毒性判定、細胞生長狀態(tài)研究等。

翊圣生物經過匠心研發(fā)提供針對真核細胞和原核細胞的雙染檢測試劑盒，滿足您的研究所需。

檢測原理

一、 細胞染色

Calcein-AM是一種常用的對活細胞進行熒光標記的細胞染色試劑，發(fā)綠色熒光（Ex=490 nm, Em=515 nm）。 因其在傳統(tǒng)的Calcein（鈣黃綠素）基礎上引入乙酰甲氧基甲酯（AM）基團，增加了疏水性，使其能夠輕易穿透活細胞膜。一旦進入細胞后Calcein-AM（本身不發(fā)熒光）被細胞內的酯酶剪切形成膜非滲透性的極性分子Calcein，從而被滯留在細胞內并發(fā)出強綠色熒光。與其它同類試劑（如BCECF-AM和CFDA)相比，由于Calcein, AM細胞毒性極低，適合用于活細胞染色的熒光探針，而且不會抑制任何的細胞功能，如增殖和淋巴球的趨化性。

由于死細胞缺乏酯酶，Calcein-AM僅用于對活細胞的細胞生存能力測試和短期標記。因此，Calcein-AM常常與死細胞熒光探針如碘化丙啶（PI）等聯合使用，同時進行活細胞和死細胞的熒光雙重染色。碘化丙啶（Propidium iodide，PI）不能穿過活細胞的細胞膜，僅能穿過死細胞膜的無序區(qū)域而到達細胞核，并嵌入細胞的DNA雙螺旋從而產生紅色熒光（Ex=535 nm, Em=617 nm），因此PI僅對死細胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激發(fā)，因此可用熒光顯微鏡同時觀察活細胞和死細胞。而用545 nm激發(fā)，僅可觀察到死細胞。本試劑盒適用于熒光顯微鏡、熒光酶標儀、流式細胞儀以及其他熒光檢測系統(tǒng)。

二、細菌染色

熒光染料DMAO是一種綠色核酸熒光染料，可將活細菌和死細菌染色。EthD-III是一種紅色核酸熒光染料，僅能對細胞膜受損的死細菌染色。將DMAO和EthD-III混合使用染色時具有完整細胞膜的細菌呈現綠色，而具有受損細胞膜的細菌呈現綠色和紅色。結果可以通過熒光顯微鏡或流式細胞儀來分析，適用于大多數細菌類型。

細菌活力的常見標準是細菌在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中繁殖的能力，稱為生長測定。該試劑盒通常與在液體或固體培養(yǎng)基中的生長測定結果有著很好的一致性。在某些條件下，膜損傷的細菌可能會在營養(yǎng)培養(yǎng)基中恢復并繁殖，而這種細菌在該測定中可能會被認為死亡。相反，一些具有完整膜的細菌可能無法在營養(yǎng)培養(yǎng)基中繁殖，但這些細菌在該測定中可能被認為是活的。因此，如果發(fā)現該檢測和細菌生長測定之間有相當大的差異，應該考慮上述的可能性。

應用檢測

使用結果

1、細胞染色結果

注：細胞類型=A375膠質瘤細胞，Calcein-AM=2 μM，PI=4.5 μM，染色時間=15min

A為Calcein-AM染色圖，B為PI染色圖，C為MERGE圖

2、細菌染色結果

注：細胞類型=大腸桿菌，EthD-III=2 ul，DMAO=4 ul，染色時間=15min

A為EthD-III染色圖，B為DMAO染色圖，C為MERGE圖

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