原代細胞培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)的方法 

原代培養(yǎng) 

原理  

    將動物機體的各種組織從機體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）

或機械方法處理，分散成單細胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長和繁殖，

這一過程稱原代培養(yǎng)。      

儀器、材料及試劑  

    儀器：培養(yǎng)箱（調(diào)整至37℃），培養(yǎng)瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液

管、紗布、手術(shù)器械、血球計數(shù)板、離心機、水浴箱（37℃）  

    材料：動物組織塊  

    試劑：1640培養(yǎng)基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒 

初代消化培養(yǎng)法 

1. 準備：取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺面，紫外線消毒20分鐘。開始工作前先洗

手、75%酒精擦拭手至肘部。 

2. 布局：點燃酒精燈，安裝吸管帽。 

3. 處理組織：把組織塊置于燒杯中，用Hanks液漂洗 2~3次，去除血污；如懷疑組織可

能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中30~60分鐘。 

4. 剪切：用眼科剪把組織切成2~3毫米大小的塊，以便于消化。加入比組織塊總量多

30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角燒瓶中，結(jié)扎瓶口或塞以膠塞。 

5. 消化：或用恒溫水浴，或置于37℃溫箱消化均可，消化中每隔20分鐘應(yīng)搖動一次，如

用電磁恒溫攪拌器消化更好。消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定。 

6. 分離：在消化過程中見消化液發(fā)混濁時，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織

已分散成細胞團或單個細胞，立即終止消化，隨即通過適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化

開的組織塊。低速（500~1000轉(zhuǎn)/分）離心消化液5分鐘，吸出上清，加入適量含有血

清的培養(yǎng)液。 

7. 計數(shù)：用計數(shù)板計數(shù)，如細胞懸液細胞密度過大，再補加培養(yǎng)液調(diào)整后，分裝入培養(yǎng)瓶

中。對大多數(shù)細胞來說，pH 要求在7.2~7.4 范圍，培養(yǎng)液呈微紅色，如顏色偏黃，說明

液體變酸，可用NaHCO3調(diào)整。 

8. 培養(yǎng)：置于36.5℃溫箱培養(yǎng)，如用CO2溫箱培養(yǎng)，瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽堵塞，

紗布塞易生霉菌，每次換液時需要換新塞。 

初代組織塊培養(yǎng)法 

1. 剪切：把組織小塊置于小燒杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血

污，吸靜Hanks液，用眼科剪反復(fù)剪切1mm3塊為止。 

2. 擺布：用彎頭吸管吸取若干小塊，置于培養(yǎng)瓶中，用吸管彎頭把組織小塊擺布在培養(yǎng)瓶

底部，小塊相互距離以0.5cm為宜，每一25ml培養(yǎng)瓶底可擺布20~30塊。 

3. 輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，另瓶底向上，注意翻瓶時勿另組織小塊流動，塞好瓶塞，置36.5℃

溫箱培養(yǎng)2小時左右（勿超過4小時），使小塊微干涸。 

4. 培養(yǎng)：從微箱中取出培養(yǎng)瓶，開塞，46度斜持培養(yǎng)瓶，箱瓶底腳部輕輕注入培養(yǎng)液少

許，然后緩緩再把培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過來，讓培養(yǎng)液慢慢覆蓋附于瓶地上的組織小塊。置溫箱中

靜止培養(yǎng)。待細胞從組織塊游出數(shù)量增多后。再補加培養(yǎng)液。 

傳代培養(yǎng)法 

原理  

    細胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細胞能繼續(xù)生長，同時 

也將細胞數(shù)量擴大，就必須進行傳代（再培養(yǎng)）。 傳代培養(yǎng)也是一種將細胞種保存下去

的方法。同時也是利用培養(yǎng)細胞進行各種實驗的必經(jīng)過程。懸浮型細胞直接分瓶就可以，

而貼壁細胞需經(jīng)消化后才能分瓶。 

材料和試劑  

1. 細胞：貼壁細胞株  

2. 試劑：0.25％胰酶、1640培養(yǎng)基（含10％小牛血清）  

3. 儀器和器材：倒置顯微鏡，培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、吸管、廢液缸等 

   操作步驟 

1. 吸除培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。 

2. 向瓶內(nèi)加入胰蛋白酶和EDTA混合液少許，以能覆滿瓶底為限。 

3. 置溫箱中2~5分鐘，當發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)回縮，細胞間隙增大后，立即終止消化。 

4. 吸除消化液，向瓶內(nèi)注入Hanks液數(shù)毫升，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶，把殘余消化液沖掉。注

意加Hanks液沖洗細胞時，動作要輕，以免把已松動的細胞沖掉流失，如用胰蛋白酶液單

獨消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液沖洗，直接加入培養(yǎng)液。 

5. 用吸管吸取營養(yǎng)液輕輕反復(fù)吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。 

6. 計數(shù)板計數(shù)后，把細胞懸液分成等份分裝入數(shù)個培養(yǎng)瓶中，置溫箱中培養(yǎng)。 

無菌操作注意事項  

1. 操作前要洗手，進入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要

擦試。  

2. 點燃酒精燈，操作在火焰附近進行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時間

不能太長，以免退火，并冷卻后才能夾取組織，吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼，以免燒

焦形成碳膜。  

3. 操作動作要準確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機會。  

4. 不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺面上用品要布局合理。  

5. 瓶子開口后要盡量保持45℃斜位。  

6. 吸溶液的吸管等不能混用。