標記抗體與Sulfo-NHS-Biotin的比率-西安瑞禧

一般每個抗體可以標記3-5個，標記時，與抗體的比率受抗體濃度影響，對于10 mg/ml 的抗體溶液來說，應(yīng)蛋白12倍（摩爾數(shù)），對于2 mg/ml 的抗體溶液應(yīng)20倍，也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。

    蛋白樣品不得含有疊氮鈉、BSA、甘氨酸、Tris或其他有自由氨基的添加物。

一、試劑和器材：

1、 標記反應(yīng)溶液：0.1M  pH 7.2 PBS（0.15M sodium chloride）

NaCl 8.77 g ；Na₂HPO₄·12H₂O 32.3g ；NaH₂PO₄·2H₂O 4.5g；加雙蒸水 900mL 左右，用HCl/NaOH 調(diào)pH 7.2，后定容為 1000mL

2、 10mM NHS-dPEG4-Biotin配方：稱取0.56mg NHS-dPEG4-Biotin（分子量為587） ，溶解于95 µl 純水中，臨用前配置，不可儲存，立刻使用。NHS-PEG4-Biotin容易潮解，開瓶前平衡室溫。也可以配置200 nmol/L 儲備液：20mg NHS-dPEG4-Biotin 溶解于170µl DMSO中，-20℃穩(wěn)定幾個月。

由于NHS-PEG4-Biotin昂貴，而且使用量少，不能保存，配制時，直接將NHS-PEG4-Biotin放入1.5ml EP管中，以實際稱量的NHS-PEG4-Biotin按比率加入純水。

3、濾管

⑴、Millipore濾管[0.5ml 10KD]:截留分子量10KD，殘留體積200µl，蛋白回收率95%，7500×g（允許的大離心力14000×g）離心10min。

⑵、Millipore濾管[0.5ml 50KD]:截留分子量50KD，殘留體積80µl，蛋白回收率94%，7500×g（允許的大離心力14000×g）離心5 min。

⑶、Amicon Ultra -0.5ml離心濾管（Millipore），效果好，的終濃縮物體積：5-15ul。

二、抗體濾處理

標記前需要應(yīng)用截留分子量為50kDa 的濾柱對抗體進行標記前純化處理(如果不是抗體，一定要按蛋白分子量來確定濾柱截留分子量)，以除去蛋白樣品中可能含有的疊氮鈉、BSA、甘氨酸、Tris或其他有自由氨基的添加物，防止干擾標記反應(yīng)。

具體操作步驟：

1、 于濾柱中加入200μl 標記反應(yīng)溶液，加入500ug 單克隆抗體，混勻。

2、 4℃，6000rpm，離心2min。棄濾液。

3、于濾柱中加入100μl 標記反應(yīng)溶液，混勻。4℃，Max 14000×g，2min。

4、 重復(fù)步驟2 6到7次。

5、 混勻濾柱中的殘留的液體，室溫靜置1min。

6、 將濾柱反轉(zhuǎn)倒置于一的濾管中，4℃，1000×g，2min，收集濾液。

7、 取50μl PBS于濾柱中混勻，靜置1min。

8、 倒置濾柱，4℃，6000rpm，2min。收集濾液，與步驟6的濾液合并，4℃放置備用。用標記反應(yīng)溶液調(diào)節(jié)抗體濃度到2mg/ml （0.25ml）。

三、標記抗體

1、 計算抗體標記需要用量。 

    抗體濃度 2 mg/ml時的簡要計算：

1mL of 2 mg/mL IgG (150,000 MW)需要26 μL of  10mM  NHS-PEG4-Biotin

具體計算方式見附錄一（標記計算）

2、 濾后的濾液加入NHS-PEG4-Biotin溶液，室溫反應(yīng)1h。

3、 葡聚糖凝膠分離純化(去除游離)：

四、葡聚糖凝膠分離純化標記抗體操作步驟：

   （一）、試劑：

 1、純化柱處理液 :100 mmol/L Na0H;

 2、純化柱平衡液: 50mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.4)，每升含0.5g NaN₃ ，8g NaCl;

3、樣品洗脫液:同純化柱平衡液;

4、標記抗體保護液（50×）: 10ml0.01M pH7.2 PBS 中加入0.5g BSA，0.2g NaN3。

（二）、凝膠過濾：

    方法見“凝膠過濾法純化微量標記蛋白”

五、標記抗體的保存方法

    將“標記抗體保護液（50×）”加入到標記抗體溶液中，使BSA終濃度為0.1%，4 ℃ 或-20 ℃ 保存。

六、數(shù)據(jù)記錄：

抗體濃度：    mg/ml        加入抗體體積：    µl

標記前抗體體積：   µl      加入NHS-PEG4-Biotin體積：    µl

純化柱規(guī)格：  cm ×   cm   凝膠體積：     ml

加入標記抗體體積：   µl        

洗脫溶液 1ml/管收集，到核酸蛋白檢測儀顯示出峰后，改為0.5ml/管收集，并記錄數(shù)據(jù)：

附錄：

一、標記計算：

   1、不同抗體濃度時，抗體與Sulfo-NHS-Biotin的比率：

     Sulfo-NHS-Biotin MW：589

  2、10mmol/L Sulfo-NHS-Biotin 配方：

3、標記計算加入體積計算：

西安瑞禧生物可以提供的定制材料包括有：

UV-Tracer Biotin NHS Ester

Biotin-EA -乙二胺

Biotinyl hexylamine

Biotin-PFP 五氟苯酯

Biotin-LC-NHS N-琥珀酰亞氨基6-氨己酸

Biotin-LC; 6-氨基己酸

4-((Biotinoyl)amino)Butyric acid ?；?4-氨基丁酸

Biotin-HZ 酰肼

LC-(+)-Biotin hydrazide CAS:109276-34-8

Biotin-HPDP cas:129179-83-5

D-Biotinol; D-醇 CAS：53906-36-8

BIOTIN DSHSE CAS:142439-92-7

Biotinyl Cystamine -半胱胺 cas:128915-82-2

Biotin-Dadps-azide

Dethiobiotin  533-48-2

Desthiobiotin NHS Ester  CAS:80750-24-9

Biotin-ONP (+)--4-硝基苯酯 33755-53-2

Biotin-L-sulfoxid；亞砜 3376-83-8

Biotin-cadaverin trifluoracetate   288259-39-2

N-Biotinyl Glycine;甘氨酸  160390-90-9

D-甲酯;DL-Biotin methyl ester  60562-11-0

Biotin修飾CdTe量子點

化修飾的聚己內(nèi)酯(PCL/Biotin)

Biotin-PEG-b-Leu

鏈霉親和素化的量子點(streptavidin-QDs)

Prazosin-PEG2000-biotin

(Biotin)表面功能化修飾多壁碳納米管

Biotin-PEG-PLL-peptide-DOX

PLL-PEG-Biotin

Biotin-PEG-c(RGDyK)

biotin-HWTX-Ⅰ標記蛛神經(jīng)虎紋捕鳥蛛-Ⅰ

ssDNA-Biotin-SA-AuNPs復(fù)合物

標記的透明質(zhì)酸(HA-biotin

PAH-Biotin修飾半胱氨酸

Biotin-Ebselen小分子探針

偶聯(lián)四氨基卟啉

磷酰化偶聯(lián)殼聚糖

Chol-Dex-Biotin 偶聯(lián)葡聚糖修飾

DOTA-Biotin偶聯(lián)大環(huán)配體造影

藻膽蛋白標記Phycobiliprotein-Biotin

藻膽蛋白-鏈霉親和素(Streptavidin-phycobiliprotein)

偶聯(lián)物OVA-ZEN-biotin

(Biotin)偶聯(lián)的多肽zs6

Biotin-DNA偶聯(lián)物

雞卵清白蛋白偶聯(lián)(Biotin-OVA)

輔A-(Coenzyme A-biotin)

FITC標記的轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf-FITC)

(biotin)修飾的ddNTP核苷酸

活化的轉(zhuǎn)鐵蛋白(Biotin-Tf)

HEMA-biotin-Lys-CD

蛤蚌-偶聯(lián)物

姜黃素-偶聯(lián)物

多肽CRGD修飾紅膜

偶聯(lián)膽甾醇化乙二醇殼聚糖

-葡聚糖聚醛偶聯(lián)物(Chol-Dex-CHO)

BIO修飾阿霉素DOX-biotin

修飾BIOTIN-Drud

CY3/CY5/CY5.5-Biotin修飾熒光染料

Biotin alkyne  773888-45-2

Biotin-PEG4-alkyne  1458576-00-5

Biotin-PEG2-C4-alkyne  1011268-28-2

Biotin-PEG4-amide-Alkyne  1006592-45-5

Dde Biotin-PEG4-alkyne  1802908-00-4

PC Biotin-PEG3-alkyne  1869922-24-6

Diazo Biotin-PEG3-alkyne  1884349-58-9

DADPS Biotin Alykne  

Biotin-PEG2-azide  1910803-72-3

Biotin-PEG3-azide  875770-34-6

Biotin-PEG4-azide  1309649-57-7

Biotin-PEG2-C6-azide  1011268-29-3

Biotin-PEG4-Picolyl azide  2222687-71-8

Biotin-SS-azide  1620523-64-9

Dde Biotin-PEG4-azide  1802907-93-2

Dde Biotin-PEG4-Picolyl azide  2055048-42-3

Diazo Biotin-PEG3-azide  1339202-33-3

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