中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室汪海林研究組在哺乳動(dòng)物基因組DNA N6-甲基腺嘌呤研究方面取得新進(jìn)展。他們發(fā)展了一套*的、無污染的6mA分析方法，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中檢測到的6mA并不依賴于甲基化轉(zhuǎn)移酶，并發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶依賴的DNA 6mA新來源。相關(guān)工作近日以N6-methyladenine is incorporated into mammalian genome by DNA polymerase為題在Cell Research雜志上發(fā)表。

DNA N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenine, 6mA）是一種在原核生物中廣泛存在的表觀遺傳修飾，但是高等真核生物中6mA的存在一直是一個(gè)難解的謎。2015年，汪海林組與陳大華組合作在Cell上發(fā)表了關(guān)于果蠅DNA 6mA修飾的研究成果。哺乳動(dòng)物DNA 6mA的研究也隨后開啟了新的里程。

但是，由于哺乳動(dòng)物DNA在樣品制備和分析過程中，容易受到原核生物DNA污染，而原核生物6mA 水平遠(yuǎn)高于哺乳動(dòng)物的，為哺乳動(dòng)物DNA 6mA的準(zhǔn)確檢測與研究帶來巨大挑戰(zhàn)。同時(shí)，研究人員也因此困惑：哺乳動(dòng)物基因組DNA中是否存在復(fù)制后可遺傳性的N6-腺嘌呤甲基化修飾？該問題一度引起業(yè)內(nèi)廣泛關(guān)注與爭議。

為了回答這一問題，汪海林研究組發(fā)展了一套*的、無污染的6mA分析方法，在樣品預(yù)處理、超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)分析中排除可能的原核生物DNA的污染，可獲得準(zhǔn)確的6mA信號。利用這一*的分析方法，在三種人細(xì)胞系和小鼠胚胎干細(xì)胞(mouse embryonic stem cells, mES細(xì)胞中檢測到6mA(圖1a, b)。研究還發(fā)現(xiàn)6mA可在細(xì)胞G1期累積。

為了進(jìn)一步探索6mA的來源，該組采用他們研發(fā)的一種*的穩(wěn)定同位素標(biāo)記方法。該法使用[15N5]-dA作為初始示蹤劑處理細(xì)胞。其中，[15N5]-dA通過補(bǔ)救合成途徑以[15N4]-dA的形式摻入基因組DNA中。理論上也可用于識別哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)甲基化轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生的6mA ([15N4]-6mA)。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)[15N5]-dA處理后，細(xì)胞DNA被[15N4]-dA有效標(biāo)記，但未能在mESC等細(xì)胞系、不同細(xì)胞周期中檢測到任何[15N4]-6mA。

該研究采用了第二種有效的同位素標(biāo)記試劑，即[13CD3]-L-甲硫氨酸，但仍然未檢檢測到任何[13CD3]-6mA。以上結(jié)果表明，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中檢測到的6mA并不依賴于甲基化轉(zhuǎn)移酶。

他們推測細(xì)胞內(nèi)6mA來源于特定DNA聚合酶的活動(dòng)。據(jù)此，采用6mA核苷直接處理mES細(xì)胞，基因組DNA中可檢測到劑量依賴的6mA摻入。隨后，分別用同位素標(biāo)記的[15N5]-6mA和RNA核苷[CD3]-m6A處理細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證，可分別檢測到[15N5]-6mA和[CD3]-6mA摻入。

那么mES細(xì)胞6mA是如何進(jìn)入基因組的呢？研究發(fā)現(xiàn)，與非同步化的細(xì)胞相比，G1期細(xì)胞中DNA聚合酶X家族成員非模板依賴性的Polλ的mRNA表達(dá)增加，而Poly λ敲低則顯著降低了G1期和sub G1期6mA水平。且Polλ敲除可導(dǎo)致[CD3]-m6A處理摻入的6mA減少。